多肽合成服务|实验技术服务

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测序实验流程：
多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质的总称，常常被应用于功能分析、抗体研究、尤其是药物研发等领域。
具体合成由下列几个循环组成：
1） 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去 除氨基的保护基团。
2） 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
3） 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA） 洗脱和脱保护。
试剂检测：没有选购在线检测附件的多肽合成仪用户，也可以采用试剂检测方法做基本的耦合效果测定实验。
固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。
Kaiser试剂包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。
其它检测游离氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等.
氨基酸保护基 
20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln ，Thr，Tyr。
多肽缩合试剂 
目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，*早使用的是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反应试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被后来的缩合试剂取代，按照其结构可以分为两种：缩合试剂主要有：碳二亚胺型，鎓盐型（Uronium）。 
液相多肽合成（solution phase synthesis） 
液相多肽合成现在仍然广泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大，合成成本低的显著优点，而且由于是在均相中进行反应，可以选择的反应条件更加丰富，象一些催化氢化，碱性水解等条件，都可以使用，这在固相中，使用却由于反应效率低，以及副反应等原因，无法应用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z两种反应策略。 
合成多肽分析鉴定方法 
多肽的分析鉴定方法有多肽**结构，二级结构鉴定，多肽**结构包括：质谱分析，氨基酸组成分析，氨基酸序列分析。二级结构包括：圆二色谱（CD），NMR，X-衍射等方法。 
纯度分析 
多肽的纯度分析，一般都采用HPLC进行分析，选择RP-C18，粒径5μm，孔径300A，4.6×150mm，流动相：A，0.1% TFA/H2O；B，0.1% TFA/ACN，洗脱梯度，5%B--65%B，时间30min。也有些多肽，特别是短肽，由于亲水性强，在C18上保留很弱，需要改变条件，这里主要有两种方法：一个改变分析梯度，可以将起始梯度改为2%，等度或小梯度洗脱；另外一个方法是在流动相中加入强离子对试剂，如七氟丁酸，十八烷基磺酸钠等。 
质谱分析 
质谱分析的目的主要是确证分子量，当然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是这个需要比较全的数据库作为基础，分析才能比较准确。由于多肽性质不稳定，需要采用软电离技术，目前多肽分析主要使用了电喷雾（ESI-MS），基质辅助激光解吸（MALDI-MS）。其中ESI-MS通常会给出多电荷峰，电荷数目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的数目有关，因此，经常给出了双电荷，三电荷等离子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情况下很少带多电荷，因此数据直接对应了分子离子峰，容易分析。此外，通常在分析长肽或蛋白过程中，需要添加NH4，Na，K等离子，提高灵敏度，所以一般在 MS中出现一组峰，分别对应：（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。 
氨基酸组成分析 
氨基酸组成分析一般需要产品的纯度较高，它可以给出多肽中氨基酸的种类，数目。分析过程首先通过酸水解破坏肽键，典型酸水解的条件是：真空条件下，110℃，用6M盐酸水解16至72小时。酸水解虽然很有用，但酸水解条件下不能获得完整的氨基酸分析，因为天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含有酰胺键，用于切断蛋白质肽键的酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸，谷氨酰胺转换为谷氨酸。由于水解温度比较高，色氨酸的吲哚环容易被空气氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚环也几乎都被破坏了。因此蛋白质的色氨酸含量往往是通过它的紫外吸收光谱估计的，也可以通过碱水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能**测定，要**测量需要在蛋白质水解之前进行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。