密码子优化服务|实验技术服务

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密码子优化服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
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测序实验流程：
功能蛋白的外源宿主表达是现代生物技术的基础，然而很多蛋白由于可能包含有抑制表达的因子：如有机体使用了不常用的密码子等，在外源宿主中很难表达。日益发展的基因设计与合成技术使通过基因设计改善蛋白表达成为可能，例如，可以通过基因设计使基因与宿主的密码子使用频率相匹配来提高蛋白表达水平。金斯瑞基因设计不仅包括密码子优化，还包括mRNA结构修正、翻译起始位点的优化等。
密码子偏爱与蛋白表达
密码子偏爱性在原核基因表达中已经被证实是一个很重要的影响因素，它引起了同一密码子在不同生物体之间，蛋白的表达水平之间以及同一操纵子的不同部位间利用率的改变。引起这种偏爱性差异的主要原因是不同细胞内可用的tRNAs量的差异。因此优化翻译系统*佳的方法就是保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡。如在大肠杆菌中，AGG和AGA所对应的tRNA分子就很少，这种差异很明显会影响基因的表达。
将低利用率的密码子替换成宿主常用密码子
通常基因中包含的密码子在特定宿主中的利用率越低，该种蛋白的表达量也就越少，甚至当这种密码子存在与蛋白簇间或者N末端的时候表达量会更少。在不改变氨基酸序列的前提下将低利用率的密码子替换为宿主常用密码子能提高功能蛋白的表达水平。
去除问题密码子
任何来源的密码子如果在宿主生物体内的利用率低于5%到10%时, 就会出现表达抑制，当这些低利用率密码子临近或相连时, 对蛋白表达的影响更大。去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子能够防止低表达或者不表达。
哺乳动物细胞表达病毒蛋白
病毒基因经过合适的处理也能在哺乳动物细胞成功表达，病毒基因密集的信息常常引起阅读框重叠，许多病毒基因能够逆序编码。病毒基因不仅表达目的蛋白也表达调控元件，因此能够平均提高蛋白表达量达28%。通过对病毒密码子进行优化以增加靶点免疫原性对于DNA疫苗的研究非常重要。
其他影响因素
虽然密码子偏爱在基因表达中起着重要的作用，但表达载体和转录启动子的选择同样重要，N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感。翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，虽然降低翻译效率会使mRNA由于缺少了核糖体的保护而更容易被endo-RNAses分解，但目前还没有它们之间影响的完整解释。稳定mRNA二级结构和接近5'端的分子也对基因表达有重要的影响。利用翻译时目的基因上游的开放式阅读框能够成功提高难度基因的表达效率。
【目的】利用密码子优化技术,提高甘油脱氢酶基因gldA在大肠杆菌中的表达水平。
【方法】针对gldA起始密码子下游区域,优先选择AT含量*高的同义密码子,从而在不改变氨基酸序列的前提下,提高该区域的AT含量。利用大引物PCR的方法对野生型gldA-WT进行定点突变,获得优化型基因gldA-4,与pET-32a（＋）连接后,构建表达质粒pET-gldA-4,转入E.coli BL21（DE3）,得到工程菌E.coli-4。同时,设定包含gldA-WT的工程菌E.coli-WT作为对照,摇瓶发酵后,以甘油为底物检测比较表达产物的酶活力。
【结果】gldA-4相对gldA-WT而言,改变了第2、5、6位密码子中的4个碱基,AT含量从53.3%提高到80.0%。相应地,E.coli-4的粗酶液的酶活力为191.3 U/mL,比E.coli-WT的48.3 U/mL提高了3倍多。