免疫沉淀|实验技术服务

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免疫沉淀|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
材料
1，  蛋白A 或蛋白G
2，  一抗
3，  免疫沉淀缓冲液：20 mM 磷酸钠, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠.
（> NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠 也可作为免疫沉淀的缓冲液，能提高蛋白G的结合功效）
4，  洗脱液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.5
5，  SDS-PAGE 上样缓冲液 (pH 6.8)： 2% SDS, 62.5 mM Tris 碱, 10% 甘油, 2-5% ,
步骤：
1，  用50 µl免疫沉淀缓冲液溶解抗原，向溶液中加入1倍过量的特异性一抗。加入免疫沉淀缓冲液至样品体积为0.2 ml。一般情况下，在此体积下2-5µg的纯化抗体能够较好地形成抗原抗体复合物。
2，  样品4°C.孵育。
3，  将适量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗体复合物中(~ 50 µl of gel per 5 µg of antibody)。
4，  室温下，轻柔混匀样品，孵育2小时。
用0.5ml免疫沉淀缓冲液洗蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物，离心2-3分钟，弃上清。重复此步骤至少6次。
5，  用50 µl洗脱液孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟，将抗原抗体复合物从蛋白A或蛋白G上洗脱下来，离心，收集上清。另用50 µl洗脱液孵育胶5分钟，离心，收上清。将两个上清混合。
6，  立即调节蛋白样品的pH至生理值，用一种合适的、多次离心的缓冲液调节，如1.0 M Tris, pH 7.5 (10 µl of this buffer to 100 µl of the supernatant should be sufficient).
7，  将洗脱成分除盐。
8，  准备好样品待定性。
NOTE：如果用SDS-PAGE定性蛋白质，省去步骤6-9。在完成第5步之前，用0.5ml蒸馏水洗胶。离心蛋白A或蛋白G 2-3分钟，弃上清。用25µl SDS-PAGE上样缓冲液在95°C孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟。样品离心，收集上清。重复一次，汇集上清至总体积50µl。由此样品则准备妥当。