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原核表达|实验技术服务

日期:2024-12-25 13:08
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摘要:关键词:原核表达|实验技术服务 简介:世界****原核表达|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。 原核表达|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。 我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。 产品品牌:原核表达|实验技术服务 http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html 测序实验流程: 原核表达载体通常为质粒,典型的表达载...
关键词:原核表达|实验技术服务
简介:世界****原核表达|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。
原核表达|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:原核表达|实验技术服务   http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程:
原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:
(1)选择标志的编码序列;
(2)可控转录的启动子;
(3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
(4)一个多限制酶切位点接头;
(5)宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下:
获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测
一、试剂准备
1、LB培养基。
2、100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
二、操作步骤
(一)获得目的基因
1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA**链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体
1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(三)获得含重组表达质粒的表达菌种
1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
(四)诱导表
1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃培养。
2、按1∶50比例稀释菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600 ≌0.4-1.0(*好0.6,大约需3hr)。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀,70℃10min。
5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。