载体构建服务|实验技术服务

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测序实验流程：
设计siRNA靶序列
在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列.研究发现对哺乳动物细胞,*有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。
1.  选择siRNA靶位点
从转录AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions,UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果 
2.  序列同源性分析
将潜在的序列和相应的基因组数据库（人或者小鼠、大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚，可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。
3.  设计阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。
合成模板
1.  合成编码 shRNA的DNA 模板的两条单链，模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamH I 和 Hind III 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamH I 和 Hind III 酶切位点之间。
2.  95℃，5 min，缓慢退火， DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。
连接与转化
1.  将100 μl感受态细胞于冰上解冻。
2.  取5 μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物，在冰上放置30分钟。
3.  将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。
4.  每管中加700 μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。
5.  室温4 000 rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100 μl培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面.注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。
6.  将平板置于室温直至液体被吸收。
7.  倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。