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总RNA提取服务|实验技术服务

日期:2024-12-26 00:57
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摘要:关键词:总RNA提取服务|实验技术服务 简介:世界****总RNA提取服务|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。 总RNA提取服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。 我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。 产品品牌:总RNA提取服务|实验技术服务 http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html 测序实验流程: (一)细胞总RNA...
关键词:总RNA提取服务|实验技术服务
简介:世界****总RNA提取服务|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。
总RNA提取服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:总RNA提取服务|实验技术服务   http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程:
(一)细胞总RNA的提取 
1、6孔板细胞汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5 min。
2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15 s。
3、室温静置2-3 min后,12000 rpm,15 min,4 ℃,离心。然后取上清无色水相(约0.6 ml)到 EP管(DEPC处理过),加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10 min。
4、12000 rpm,10 min,4 ℃,离心。观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清,75%乙醇1.0 ml洗涤(用DEPC水新配制)后,7500 rpm,5 min,4 ℃离心。
5、去上清,点离,用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10 min, DEPC处理水20-30 μl加入,中枪打匀,55-60 ℃水浴10 min溶解总RNA,测OD值。
6、电泳。
(二)从总RNA中分离mRNA(Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN)
1、取上述提取的总RNA若干(少于0.25 mg)到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀。
3、70℃水浴,3 min(裂解RNA的二级结构)。
4、20-30℃条件下,静置10 min(让Oligotex与mRNA结合)。
5、高速离心2 min,小心吸走上清(该上清要保留),留下约50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1 min。
7、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 μl到柱子,高速离心1 min,丢掉滤过液。
8、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 μl热的(70 ℃)Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4 次,高速离心1 min。
10、电泳。
9、为保证*大的 mRNA产量,可再次重复第8步。
1. 六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol,冰上放置5min,枪头吹打。
2.  将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中,加入氯仿0.2ml/管,用力振摇15s。15-30℃下孵育2-3min,离心(4℃,12,000g,15min)。
3.  离心后液体分为三层(上层-无色水样层为RNA,中层白色为DNA和底层红色为蛋白质),小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
4. 加入等体积异丙醇,0.4-0.5ml,混匀,15-30℃下孵育10-30min,离心(4℃,12,000g,10min)。其中如果加入等体积异丙醇后,置于试管架上用PE手套密封后,放于4℃冰箱中,沉淀30min效果更好。
5. 去上清,沉淀加入75%乙醇1ml,漩涡振荡30s,离心(4℃,7,500g,5min)。
6.  小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。*好是用枪头吸取上清,尽量除去。
7. 加入20ul DEPC水溶解,分装5ul/管,-70℃冰箱保存。
8. 细胞总RNA的鉴定:0.9-1.2%琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA,观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定:分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。