滑膜细胞原代培养技术服务|实验技术服务

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滑膜细胞原代培养技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
方法
1.   将切下的组织在手术台上请将标本放入低温生理盐水中(静止)，在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室。
2.  在超净台中将标本放入培养皿中，加入α-MEM洗涤。
3.  获得组织切开，仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织，附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织(可作另一管消化)，仔细剔除脂肪组织，用α-MEM洗二次(以去除红细胞)，放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎。
4.   用双倍获得组织的体积含有4 mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM消化37℃孵育120分钟(在此期间震动混匀数次)
5.   30分钟后收集**管细胞：细胞悬液经70 μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟，上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织，继续用于消化。
6.   离心管底细胞用α-MEM离心洗涤2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转，离心6分钟，*后一次用记数板观察到有细胞。细胞*终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接种到培养瓶中培养。
7.  60钟后收集**管细胞：细胞悬液经70 μm细胞滤网过滤，用1500-2000 rpm离心6分钟；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000 rpm离心6分钟，*后一次用记数板观察细胞并计数。细胞*终悬浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接种到培养瓶中培养。
8.   必要时可做第三管细胞收集；并立即作原代滑膜细胞培养。
9.  每2-3天换液一次。
实验材料：
1. 实验动物：大鼠、兔，人手术切除的关节等；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100µg/ml链霉素，pH7.2；
3. 培养液：RPMI1640培养基，补加15%小牛血清；
实验方法：
1. 将大鼠处死后，用75%酒精消毒；
2. 用手术剪剖开其四肢皮肤与肌肉，暴露长骨两端的关节，取出关节面滑膜组织置于盛有缓冲液的培养皿中；
3. 剔除滑膜组织外层结构及周边软骨组织，用缓冲液洗2—3次；
4. 将滑膜组织置于盛有少量小牛血清的培养皿中，剪碎成1mm×1mm×1mm大小的植块；
5. 将制备的植块接种到螺旋口培养瓶中。反转培养瓶，使植有组织块的一面朝上，加入培养液，盖好瓶盖。将培养瓶放入含5%CO2的培养箱中在37℃条件下进行培养；
6. 培养4h后，组织块较牢黏附于瓶底时，再轻轻反转培养瓶，继续培养；
7. 培养3d后换培养液。
注意事项
1.   用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02% EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化细胞或合用，只有单用collagenaseⅠ有用、*好；
2.   机械法很难获得细胞；
3.  全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用国产即可；
4.  必须用Ca2+-free的PBS。