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iFOLD蛋白重折叠三兄弟
俗话说，巧妇难为无米之炊，蛋白质的结构与功能研究当然也离不开大量的高纯蛋白。要想获得大量蛋白，娇贵的哺乳动物细胞可很难做到，主要依靠大肠杆菌表达系统，操作简单，价格便宜量又足。然而，大肠杆菌中生产的外源蛋白量是不少，却常常形成包涵体，让人欢喜让人忧。虽说包涵体也有不少优点，诸如易纯化、耐蛋白水解等，但要想摸索出合适的条件，让包涵体重折叠成天然的构象，自然少不了一番周折。如果能同时筛选多个重折叠条件，那将会节省不少时间，且增加成功的几率，起到事半功倍的效果。
默克旗下Novagen就开创性地推出了这样的系统——iFOLD蛋白重折叠三兄弟。这三兄弟各带有一块96孔板，上面分别有92（老大）、94（老二）和91（老三）种独特的缓冲液。这些缓冲液成分是根据REFOLD数据库（http://refold.med.monash.edu.au）和众多成功重折叠的文献而确定的，内含特定pH值、盐、环式糊精、氧化还原试剂以及重折叠添加剂的不同组合。

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iFOLD三兄弟中的老幺是在去年底上市的，它的独特之处是采用全新的化学试剂—FoldACE—作为主要的复性添加剂。这个FoldACE试剂是什么来头？有什么好处呢？它是从一个能增加蛋白回收率的化学试剂库中筛选出来的。FoldACE试剂共有五种，每一种都是水溶性的有机盐，分子量小于500Da。它们不是去污剂，也不会形成胶束。在蛋白复性之后，FoldACE试剂可以通过金属螯合亲和层析或分子筛的方法有效去除，透析或超滤也可以。实验表明，它们能显著增强某些蛋白的折叠效率。
除了FoldACE试剂，iFOLD3系统复性缓冲液的pH缓冲液成分也是五选一，分别是Bis-Tris、MOPS、HEPES、EPPS和TAPS。孔中还包含了还原剂（TCEP）或谷胱甘肽氧化还原缓冲液。iFOLD3能根据不同的缓冲液、pH值、氧化还原剂和FoldACE试剂的组合，筛选一个蛋白的91种复性条件（91个实验孔和5个对照孔）。
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筛选流程如下：
起始物质：包含目标蛋白的细胞 → 收集细胞 → 超声裂解细胞，并加入Lysonase生物处理试剂 → 离心收集包涵体 →用Triton X-100洗涤包涵体 → 用盐酸胍变性包涵体 → 用iFOLD 3平板快速复性目标蛋白 → 用D-Tube96透析器透析缓冲液 → 分析复性蛋白
iFOLD 蛋白重折叠三兄弟的比较：

 

 
iFOLD 系统1
iFOLD 系统2
iFOLD 系统3
包涵体洗涤剂
1.0%Triton-X-100
0.125 MNDSB-201(或Triton X-100)
1.0%Triton-X-100（或NDSB-201）
包涵体变性剂
4.4%N-lauroylsarcosine
7.0 MGuHCl（或8.0 M尿素）
7.0 MGuHCl
包涵体还原剂
5 mMTCEP
10 mMTCEP
1.0 mMTCEP 1
5.0 mMTCEP 2
6.0 mM+ 4.0 mM GSH + GSSG1
8.0 mM+ 2.0 mM GSH + GSSG2
9.5 mM+ 0.5 mM GSH + GSSG3
变性的目标蛋白浓度
1mg/ml
5mg/ml
10mg/ml
每孔中的总蛋白
50 ug
50 ug
100 ug
缓冲液体积（50 mM）
Tris-HCl, pH 7.0,7.5, 8.0或8.5
MOPS, pH7.0
HEPES, pH7.5
EPPS, pH8.0
TAPS, pH8.5
CHES, pH9.0
Bis-Tris, pH6.0
MOPS, pH7.0
HEPES, pH7.5
EPPS, pH8.0
TAPS, pH8.5
重折叠添加剂
100mMNaCl
250mMNaCl
1.0mMTCEP
3.8mMGSH + 1.2 mM GSSG
1.0mMEDTA
1.0mMCaCl2 + 1.0 mM MgCl2
0.5MGuHCl
20%glycerol
0.1%PEG6000
0.5ML-arginine
12.5mM环式糊精
24mMNaCl + 1.0 mM KCl
240mMNaCl + 10 mM KCl
1.0mMTCEP
9.0mMGSH + 1.0 mM GSSG
6.0mMGSH + 4.0 mM GSSG
1.0mMEDTA
0.25mMeach of CaCl2,MgCl2,MnCl2 & ZnCl2
0.5 or 1.0 MNDSB-201
0.5 or 1.0 MNDSB-256
1.5Msorbitol
0.58Mtrehalose
0.06%PEG3350
0.5ML-arginine
10mM环式糊精
FoldAce试剂1
FoldAce试剂2
FoldAce试剂3
FoldAce试剂4
FoldAce试剂5

 

iFOLD系统的特征包括：
  • 覆盖近300个重折叠条件
  • 包括纯化包涵体的所有试剂
  • 含有96孔板重折叠缓冲液矩阵
  • 测试pH范围在7.0-9.0之间
  • 重折叠添加剂包括盐、环式糊精、氧化还原剂、；离液盐、NDSB和独特的FoldACE试剂
  • 重折叠条件基于众多文献和REFOLD数据库
    有了iFOLD重折叠三兄弟的帮助，相信枯燥冗长的实验摸索可以很快完成，并让你迅速走上蛋白结构与功能研究的光明大道。
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