实验外包- TUNEL细胞凋亡检测注意事项
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1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min.用无水乙醇洗两次,每次3min.用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min.用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml）,于室温水解15min,去除组织蛋白.用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作.
（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体.用PBS洗两次,每次5min.置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体.用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作.
TUNEL细胞凋亡检测注意事项
出现非特异性荧光标记
a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。
b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。
c. TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。
荧光背景很高
a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。
b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。
d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
标记效率低
a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。
b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。
c. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
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