鸡胚胎成纤维细胞；UMNSAH/DF-1

实验材料： 

1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 

2. 100ml烧杯2个；
3、50ml离心筒2个 

4、培养皿1个，细胞培养瓶1个 

5、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个 

6、细胞计数板1块； 

7、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； 

8、酒精灯1台；

形态特性：成纤维母细胞样

生长特性：贴壁生长

培养条件：DMEM(高糖）+10%FBS（gibco）

传代方法:1：2传代

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冻存培养基：

冻存细胞时必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有DMSO 或者甘油等冷冻保护剂。还可使用专门配制的完全冻存培养基。

1）细胞冻存培养基是一种用于哺乳动物细胞的即用型完全冻存培养基，其所含胎牛血清和牛血清比例经过优，可改善细胞活力以及解冻后的细胞复苏效果。 

2）冻存培养基是一种化学成分确定的、无蛋白、无菌冻存培养基，含10% DMSO，适用于多种干细胞和原代细胞 (黑色素细胞除外) 的冻存。

培养细胞冻存方案：

以下实验方案介绍了培养细胞冻存的一般流程。详细的实验方案，必须参阅针对具体细胞的产品说明书。 

1.配制冻存培养基，于2°C至8°C下储存，直至使用。请注意使用何种冻存培养基取决于所用细胞系。

2.冻存贴壁细胞时，利用传代时所用方法轻柔地使细胞从组织培养容器上脱离下来。用该细胞所需完全培养基重新悬浮细胞。

3.采用血球计数器、细胞计数仪按照台盼蓝拒染法或者使用自动细胞计数仪测定总细胞数和活细胞百分比。根据所需活细胞密度，计算冻存培养基需要量。

4.以大约100-200×g的离心力将细胞悬液离心5至10分钟。在无菌条件下小心倒掉上清液，不要搅动细胞沉淀。

注：离心速度和时间取决于细胞种类。

5.用预冷的冻存培养基重新悬浮细胞沉淀，将其调整至该细胞适合的活细胞密度。

6.将细胞悬液分装到若干冻存管中。分装时，应不时轻轻混合细胞，使其保持均匀的细胞悬液状态。

7.使用可控制降温速度的冷冻装置冷冻细胞，使温度每分钟大约降低1°C。或者，将装有细胞的冻存管放入冻存盒中，然后将冻存盒置于-80°C条件下过夜。 
4-氟-2-三氟 99%GLUT3(Human Glucose transporter 3) ELISA Kit  人葡萄糖转运蛋白3兔硫氧还蛋白结合蛋白2(TBP2)酶联吸附测定试剂盒

2-氟-5-三氟 98%RBP(Human Retinol binding protein) ELISA Kit  人视黄结合蛋白兔转化生长因子β诱导蛋白(TGFβI)酶联吸附测定试剂盒

3-氟-5-三氟 97%8-OHdG(Human hydroxylysine) ELISA Kit  人8羟脱氧鸟苷兔复制蛋白A(RPA-70)酶联吸附测定试剂盒

4-氟-3-三氟 99%Hyl(Human hydroxylysine) ELISA Kit  人羟赖氨兔肺癌标志物DR-70(DR-70TM)酶联吸附测定试剂盒

2-氟三氟 99%GAP(Human GTPase activating protein) ELISA Kit  人GTP酶活化蛋白兔二酯酶4D(PDE4D)酶联吸附测定试剂盒

4-氟三氟 98%Apo-H(Human Apolipoprotein H) ELISA Kit  人载脂蛋白H兔凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)酶联吸附测定试剂盒  

2-氟-4- 98%GPI(Human glycophosphatidylinositol) ELISA Kit  人糖脂酰肌兔α半糖抗原(Gal)酶联吸附测定试剂盒

2-氟-3-PWM(Human pokeweed mitogen) ELISA Kit  人美洲商陆素兔S100钙结合蛋白A9(S100A9)酶联吸附测定试剂盒

2-氟-4- 98%LPS(Human Lipopolysaccharides) ELISA Kit  人脂多糖/内素兔S100钙结合蛋白A6(S100A6)酶联吸附测定试剂盒

2-氟-5- 99%Human preptin ELISA Kit  人preptin兔胸腺质**素(TSLP)酶联吸附测定试剂盒

2-氟-5- 98%PPAR- Alpha(Human peroxisome proliferators activator receptors alpha) ELISA Kit  人过氧化物酶体增殖物激活受体α兔肺表面活性物质相关蛋白B(SPB)酶联吸附测定试剂盒

3-氟-2- 99%Apo-E(Human Apolipoprotein E) ELISA Kit  人载脂蛋白E兔碱性成纤维生长因子(bFGF/FGF2)酶联吸附测定试剂盒

3-氟-4- 98% OGP(Human Osteogenic Growth Peptide) ELISA Kit  人成骨生长肽兔性成纤维生长因子(AFGF/FGF1)酶联吸附测定试剂盒

3-氟-5- 97%ODF(Human osteoclast differentiation factor) ELISA Kit  人破骨分化因子兔集落激因子(CSF)酶联吸附测定试剂盒

4-氟-3- 98%OH-PYD(Human Hydroxy-Pyridinium crosslinks) ELISA Kit  人羟胶原吡啶交联兔生长停滞特异性蛋白6(Gas6)酶联吸附测定试剂盒
鸡胚胎成纤维细胞；UMNSAH/DF-1血管**素样蛋白6Elisa试剂盒Cy3标记的羊抗大鼠IgGPCDHGA1  原钙粘蛋白γA1抗体

Argonaut-1蛋白Elisa试剂盒Cy5标记的羊抗大鼠IgGPCDHB7  原钙粘蛋白β7抗体

水通道蛋白8Elisa试剂盒Cy5.5标记的羊抗大鼠IgGPCDHB5  原钙粘蛋白β5抗体

化乙酰辅酶AElisa试剂盒Cy7标记的羊抗大鼠IgGPCDHB4  原钙粘蛋白β4抗体

化乙酰辅酶A羧化酶Elisa试剂盒Alexa Fluor 555标记的羊抗大鼠IgGPCDHB3  原钙粘蛋白β3抗体

酪氨羟化酶Elisa试剂盒Alexa Fluor 647标记的羊抗大鼠IgGPCDHB2  原钙粘蛋白β2抗体

NEL样蛋白2Elisa试剂盒辣根过氧化物酶标记的羊抗豚鼠IgGPCDHB16  原钙粘蛋白16抗体

Ⅲ型前胶原Elisa试剂盒生物素标记的羊抗豚鼠IgGPCDHB15/PCDHB22  原钙粘蛋白15抗体

CA16-IgGElisa试剂盒Cy5标记的羊抗豚鼠IgGPCDHB13  原钙粘蛋白13抗体
细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。