胆管细胞型肝癌细胞；HCCCS-9810

实验材料： 

1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 

2. 100ml烧杯2个；
3、50ml离心筒2个 

4、培养皿1个，细胞培养瓶1个 

5、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个 

6、细胞计数板1块； 

7、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； 

8、酒精灯1台；

形态特性：上皮细胞样

生长特性：贴壁生长

特征特性：HCCCS-9810细胞株源自一位女性肝胆管细胞癌患者。HCCCS-9810细胞呈上皮细胞样，染色体模式数为71，但染色体数目可以在22-117的范围内变动。倍增时间为20.4小时。AFP，CA-A和CA19-9的分泌水平低，在裸鼠中的成瘤率为20%。

培养条件：RPMI-1640(GIBCO,添加NaHCO31.5g/L,glucose2.5g/L,SodiumPyruvate0.11g/L)，90%；胎牛血清，10%。气相：空气，95%；二氧化碳，

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冻存培养基：

冻存细胞时必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有DMSO 或者甘油等冷冻保护剂。还可使用专门配制的完全冻存培养基。

1）细胞冻存培养基是一种用于哺乳动物细胞的即用型完全冻存培养基，其所含胎牛血清和牛血清比例经过优，可改善细胞活力以及解冻后的细胞复苏效果。 

2）冻存培养基是一种化学成分确定的、无蛋白、无菌冻存培养基，含10% DMSO，适用于多种干细胞和原代细胞 (黑色素细胞除外) 的冻存。

培养细胞冻存方案：

以下实验方案介绍了培养细胞冻存的一般流程。详细的实验方案，必须参阅针对具体细胞的产品说明书。 

1.配制冻存培养基，于2°C至8°C下储存，直至使用。请注意使用何种冻存培养基取决于所用细胞系。

2.冻存贴壁细胞时，利用传代时所用方法轻柔地使细胞从组织培养容器上脱离下来。用该细胞所需完全培养基重新悬浮细胞。

3.采用血球计数器、细胞计数仪按照台盼蓝拒染法或者使用自动细胞计数仪测定总细胞数和活细胞百分比。根据所需活细胞密度，计算冻存培养基需要量。

4.以大约100-200×g的离心力将细胞悬液离心5至10分钟。在无菌条件下小心倒掉上清液，不要搅动细胞沉淀。

注：离心速度和时间取决于细胞种类。

5.用预冷的冻存培养基重新悬浮细胞沉淀，将其调整至该细胞适合的活细胞密度。

6.将细胞悬液分装到若干冻存管中。分装时，应不时轻轻混合细胞，使其保持均匀的细胞悬液状态。

7.使用可控制降温速度的冷冻装置冷冻细胞，使温度每分钟大约降低1°C。或者，将装有细胞的冻存管放入冻存盒中，然后将冻存盒置于-80°C条件下过夜。 
3-氟酰 98%AP36(Human Apelin 36) ELISA Kit  人Apelin 36兔阿黑皮素原(POMC)酶联吸附测定试剂盒

间二酰 99%Tn-T(Human Troponin T) ELISA Kit  人肌钙蛋白T兔抗乙酰胆碱受体抗体(Anti-AChR)酶联吸附测定试剂盒

对酰 98%ES-Ab(Human anti-Endostatin antibody) ELISA Kit  人血管内皮抑素抗体兔血小板型果糖激酶(PFKP)酶联吸附测定试剂盒

对二酰 99%Agtr I a(Human angiotensin II receptor type I a) ELISA Kit  人血管紧张素Ⅱ受体Ⅰa型兔血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)酶联吸附测定试剂盒

乙酰 98%ANGPTL3(Human angiopoietin-like protein 3) ELISA Kit  人血管**素样蛋白3兔脑源性神经营养因子(BDNF) 酶联吸附测定试剂盒

4'-叔丁-4-丁酰 98%Alpha Actin(Human Alpha-Actin) ELISA Kit  人α肌动蛋白兔核因子κB (NFκB)酶联吸附测定试剂盒

维生素K1 98%ANKRD1(Human cardiac ankyrin repeat domain 1) ELISA Kit  人心肌锚蛋白重复域1兔胶原酶I(Collagenase I)酶联吸附测定试剂盒  

5-己炔-1- 96%LEPR(Human Leptin Receptor) ELISA Kit  人瘦素受体兔XIV型胶原 (COL14)酶联吸附测定试剂盒

1-辛炔 99%AT2R(Human Angiotensin II Receptor 2) ELISA Kit  人血管紧张素Ⅱ受体2兔谷氨半胱氨连接酶修饰亚(GCLM)酶联吸附测定试剂盒

对酰  >98.0%(GC)ANG II R-1(Human angiotension II receptor 1) ELISA Kit  人血管紧张素Ⅱ受体1兔精氨酶(Arg)酶联吸附测定试剂盒

间酰 97%ANG-4(Human Angiopoietin 4) ELISA Kit  人血管**素4兔糖原合成酶激酶3β(GSK3β)酶联吸附测定试剂盒

邻酰 98%sMHC-1(Human soluble myosin heavy chain 1) ELISA Kit  人可溶性肌球蛋白重链1兔CC趋化因子受体1(CCR1)酶联吸附测定试剂盒

二烷 CP，98%HSF-1(Human Heat Shock Factor 1) ELISA Kit  人热休克因子1兔神经肽Y(NPY)酶联吸附测定试剂盒

二烷 99%VPI(Human vasopeptidase inhibitors) ELISA Kit  人血管活性肽酶抑制剂兔过氧化物酶体增殖物激活受体γ( PPAR-γ)酶联吸附测定试剂盒

对酰 98%CMLC-1(Human Cardiac myosin-light chains 1) ELISA Kit  人心肌肌凝蛋白轻链1兔生长调节致癌因β(GROβ)酶联吸附测定试剂盒  
胆管细胞型肝癌细胞；HCCCS-9810骨成型蛋白Elisa试剂盒碱性酶（AP）标记的兔抗亲和素OCT1  阳离子转运器1抗体

可溶性甘露糖结合凝集素2Elisa试剂盒胶体金标记的兔抗亲和素Oct-1  胚胎干关键蛋白1抗体

膜受体蛋白Elisa试剂盒辣根过氧化物酶标记的兔抗亲和素OCLN/Occludin  紧密连接蛋白抗体

网状蛋白4Elisa试剂盒Cy5.5标记的兔抗亲和素OCIAD2  卵巢癌反应抗原抗体

网状蛋白4BElisa试剂盒Cy7标记的兔抗亲和素OCIAD1  卵巢癌反应抗原抗体

含主要协助转运蛋白超家族域蛋白2AElisa试剂盒PE标记的兔抗亲和素OCEL1  紧密连接蛋白/小分子胶原蛋白OCEL1抗体

NDUFB4Elisa试剂盒Cy3标记的兔抗亲和素OCC1  结肠癌过度表达蛋白1抗体

NDUFB8Elisa试剂盒Cy5标记的兔抗亲和素OAT4L/URAT1  尿盐重吸收转运子1抗体

化过氧化物酶体增殖因子活化受体γElisa试剂盒生物素标记的兔抗亲和素OAT-3  阴离子转运蛋白-3抗体
细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。