RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表达感受态

商品属性：

储存条件：

RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表达感受态RTS 系列感受态为干粉形式，均可室温保存 3 天，长期保存-20°C（2 年）。经 Nano E.coli Transfection Reagent溶解后的感受态必须分装后，并于-60°C 以下保存。溶解后的感受态细胞避免反复冻融，在-60°C 以下可保存 6 个月。

产品介绍：

BL21(DE3) Chaprone 感受态细胞中含有分子伴侣蛋 白质粒，其表达产物可协助重组蛋白正确折叠形成可溶活性 蛋白。分子伴侣蛋白质粒为氯霉素抗性（chloramphenicol， Cmr）的表达受控于四环素（tetR）操纵子，因此该感受态 不适用于氯霉素抗性表达质粒的转化。 本品使用 独有的化学感受态**技术制备， 其室温可保存 3 天、-20°C 可保存 2 年（推荐保存温度）、 -80°C 可长期保存性能无下降。运输过程中无需干冰，可常 规冰袋运输（推荐运输温度）。该感受态细胞为热激感受态 细胞，转用于蛋白表达（不可用于克隆和载体构建），经 42°C 热激 1min 可获得 105～106 cfu/μg 效价，可满足质粒转化要 求。该制品使用简单、运输、储存方便。 
组分
RTS BL21(DE3)Chaprone Competent Cell（10T） 1 瓶
Nano E.coli Transfection Reagent 1 mL

操作方法：

1. 从-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent彻底融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli TransfectionReagent 加入到一支冻干感受态细胞中，并分装到 10 支 1.5ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。
2. 将 10～100 ng 质粒 DNA（不可使用连接产物、不可使用氯霉素筛选标记质粒）加入到分装的感受态细胞中，轻弹EP 管（或枪头轻轻吹打），置于冰上 15min。
3. 置于 42°C 热激 1 min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。
4. 热激完毕后，向上述感受态细胞中加入 450 μL 不含***的 SOC（或 LB）培养基，37 °C 振荡（225 rpm）培养60 min。使质粒上抗性标记基因表达，菌体复苏。
5. 取200 μl复苏菌液涂布到含相应***的LB琼脂平板表面。（含相应质粒***和 20 μg/ml 氯霉素）
6. 将平板置于 37 °C 培养，12~18 小时后可出现菌落。
7. 挑选生长良好的菌落，接入 LB 培养基（含相应质粒***，20 μg/ml 氯霉素），37 ℃剧烈振荡培养过夜。
8. 1/50 比例接入新的 LB 培养基（含相应质粒***，20μg/ml 氯霉素，0.5 mg/ml L-阿拉伯糖）37 ℃剧烈振荡培养至菌体密度 OD600 约 0.3（约 2h）。
9. 加入终浓度 2 ng/ml 四环素（诱导 chaprone 伴侣蛋白表达），37℃剧烈振荡培养至 OD600 约 0.5（约 2~4h）。
10. 加入适量 IPTG(0.1-1 mM), 15℃振荡培养 24h（培养摇床无法制冷条件下，室温诱导 8～12h）。
11. 4,000 rpm 室温离心 15 min，收集细胞，进行蛋白表达和可溶性表达分析。

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注意事项：

1.操作容易：将组织剪成适当大小，浸没在RNAfixer 中即可使其RNA 不被降解。
2.无需液氮：使样品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其适用于临床和野外样品的快速和大规模采集。
3.方便运输：处理过的样品能在25℃保存一周,使样品邮寄和运输变得容易和便宜,有利学术合作和交流。
4.多次冻融: 经RNAfixer 处理的样品可反复冻融多次, 其间可对样品进行各种处理而不影响*终提取的RNA 的质量。
5.可比性强: RNAfixer 能减少大规模样品处理中的误差,增加各次实验数间的可比性, 对大规模基因表达谱的分析尤其有用。

操作步骤：

RNAfixer 只用于新鲜组织，浸泡入 RNAfixer 前禁止冷冻组织。只需要迅速将新鲜组织剪成长、宽，高任意一边厚度<0.5 厘米浸泡入 RNAfixer 即可（只要有一边厚度不超过 0.5 厘米，RNAfixer 可以迅速渗透，其它两边的尺寸并不重要）。将新鲜组织浸泡 在 5 倍体积的 RNAfixer 中，按照指示存放在适当的温度。
1.动物组织 RNAfixer 并不破坏或者溶解组织结构，因此浸泡在 RNAfixer 中达到渗透平衡的组织 可以从 RNAfixer 中取出，然后切成更小的块，然后放回到 RNAfixer 中下次继续使用。小器官如小鼠肝、肾、脾不需要剪切,可以完整的存放在 RNAfixer 中。

2.植物组织很多植物组织直接浸泡入 RNAfixer 即可，有的植物有天然渗透屏障如腊质保护层，需要先破坏掉腊质层,便于 RNAfixer 渗透。
3.组织培养细胞细胞吹打下来后,离心收集细胞,弃上清，用冰浴的 PBS 缓冲液洗一次去除残留培养液。将细胞悬浮在少量 PBS 缓冲液中。加入五到十倍体积 RNAfixer, 混均。
4.白细胞对于全血中白细胞的保存，需将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在 RNAfixer 中。不要将全血、血浆或血清中的 RNA 保存在 RNAfixer 中，因为它们蛋白含量过高，与 RNAfixer 混合后易形成不溶的沉淀。
5.**
**并不能在 RNAfixer 中生长，但是 RNAfixer 并不破坏**，E. coli 在 4℃保存一个月仍旧可以提出完整的 RNA。
RNAfixer 中样本的存放：
1.存放在-80℃样品长期保存用。将 RNA fixer 中样本放置于 4℃过夜，然后将样本捞出，尽量去除干净 RNAfixer 液体，然后放置于-80℃。对于组织培养细胞，则不需要去除RNAfixer，直接冷冻于-80℃，并不会裂解细胞。样品使用时可以在室温融化，并且还可以再次冷冻而不影响 RNA 的完整性和产量。
2.存放在-20℃将 RNAfixer 中样本放置于 4℃过夜，然后转移到-20℃。在-20℃样品并不会被冰冻,但是可能会形成一些结晶，这并不会影响将来的 RNA 提取。样品使用时可以在室温 融化，并且还可以再次冷冻而不影响 RNA 的完整性和产量。
3.存放在 4℃样本可以在 4℃存放一个月。
4.存放于 25℃存放于 25℃样本的 RNA 在一周内保持完整，保存两周的样品 RNA 有轻微降解，勉强能用于northern analysis, 但是质量足够用于nuclease protection assay or RT-PCR 。
5.存放于 37℃存放于 37℃样本的 RNA 在 24 小时内保持完整，3 天的时候有部分降解。RNAfixer 保存样本的 RNA 提取：将样本从 RNAfixer 中取出,RNAfixer 可以直接倒入水池，用自来水冲即可，不需特殊处理。
1.组织
用干净镊子将样本从 RNAfixer 中捞出，用吸水纸稍稍吸去残留的 RNAfixer 后，可以和新鲜组织一样按照液氮研磨，然后匀浆处理的标准程序进行提取 RNA。
2.细胞
对于储存在 RNAfixer 中的细胞有两种选择。一是去除 RNAfixer 后提取 RNA, 另一个是直接从细胞和 RNAfixer 的混合物提取。
1）去除 RNAfixer 后提取 RNA存放于 RNAfixer 中的细胞变得不那么脆弱，可以承受较高的离心速度而不被裂解。 我们有在 5000g 离心成功收集细胞的经验，由于每种细胞的强度不一样，可以先用不重要的细胞做个预试验，以保证在使用的速度下离心不会破坏细胞。另一个选择是在离心前加等体积的 PBS 稀释 RNAfixer 和细胞的混合物，以减少溶液的密度，使细胞溶液可以沉淀下来。
2）不去除 RNAfixer，直接提取 RNA
也可以直接加 10 倍体积的一步法提取试剂（如 TRIpure，TRI reagent）到细胞和RNAfixer 的混合物，然后按照正常步骤操作。

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