高效液相色谱仪测定原料乳与乳制品中三聚氰胺含量
1、原理
试样用三***溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。
2、试剂与材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的上等水。
2.1 甲醇：色谱纯。
2.2 乙腈：色谱纯。
2.3 氨水：含量为25％～28％。
2.4 三***。
2.5 柠檬酸。
2.6 辛烷磺酸钠：色谱纯。
2.7 甲醇水溶液：准确量取 50 mL 甲醇和 50 mL 水，混匀后备用。
2.8 三***溶液（1％）：准确称取10 g 三***于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
2.9 氨化甲醇溶液（5％）：准确量取 5 mL 氨水和 95 mL 甲醇，混匀后备用。
2.10 离子对试剂缓冲液：准确称取 2.10 g 柠檬酸和 2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约 980 mL 水溶解，调节 pH 至 3.0 后，定容至 1L 备用。
2.11 三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于 99.0%。
2.12 三聚氰胺标准储备液：准确称取 100 mg（准确到 0.1 mg）三聚氰胺标准品于 100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为 1 mg/mL 的标准储备液，于 4℃避光保存。
2.13 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相当者。使用前依次用 3 mL 甲醇、5 mL 水活化。
2.14 定性滤纸。
2.15 海砂：化学纯，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化硅（SiO 2 ）含量为99％。
2.16 微孔滤膜：0.2 µm，有机相。
2.17 氮气：纯度大于等于 99.999％。
3、仪器和设备
3.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器。
3.2 分析天平：感量为0.0001 g和0.01 g。
3.3 离心机：转速不低于 4000 r/min。
3.4 超声波水浴。
3.5 固相萃取装置。
3.6 氮气吹干仪。
3.7 涡旋混合器。
3.8 具塞塑料离心管：50 mL。
3.9 研钵。
4、样品处理
4.1 提取
4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等：称取2 g （准确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三***溶液和 5 mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三***溶液润湿的滤纸过滤后，用三***溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。
4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等：称取2 g（准确至0.01 g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转移至50 mL具塞塑料离心管中，用15 mL三***溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中 ，再往离心管中加入5 mL乙腈，余下操作同4.1.1中“超声提取10 min，加入5 mL水混匀后做待净化液”。
注：若样品中脂肪含量较高，可以用三***溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化 。
4.2 净化
将4.1中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用 3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干 后 ，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于 0.4 g 样品）用 1 mL流动相定容，涡旋混合1 min ，过微孔滤膜后，供HPLC测定。
5、高效液相色谱仪测定
5.1 高效液相色谱仪参考条件
a) 色谱柱：C 8 柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者；
C 18 柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相当者。
b) 流动相：C 8 柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（85+15，体积比），混匀。
C 18 柱，离子对试剂缓冲液（3.2.10）-乙腈（90+10，体积比），混匀。
c) 流 速：1.0 mL/min。
d) 柱 温：40℃。
e) 波 长：240 nm。
f) 进样量：20 μL。
5.2 标准曲线的绘制
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.8、2、20、40、80 μg/mL 的标准工作液 ，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品。
5.3 定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
5.4 结果计算
试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：
…………………… （1）
式中：
X —— 试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg ）；
A —— 样液中三聚氰胺的峰面积；
c —— 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL ）；
V —— 样液*终定容体积，单位为毫升（mL ）；
A s —— 标准溶液中三聚氰胺的峰面积；
m —— 试样的质量，单位为克（g ）；
f —— 稀释倍数。
高效液相色谱仪测定原料乳与乳制品中三聚氰胺含量
高效液相色谱仪测定原料乳与乳制品中三聚氰胺含量
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