高效液相色谱仪测定灵芝中活性成分含量
灵芝子实体中主要含有三萜类、多糖及蛋白质等活性成分 。灵芝也含有**类的特征成分麦角甾醇。本文采用紫外分光光度法和高效液相色谱仪分别测定这4类活性成分。
1、仪器与试剂
高效液相色谱仪配紫外检测器；
紫外可见分光光度计；
电恒温水浴锅；
电子分析天平：0.1mg；
超声波清洗机；
高速离心机；
D-葡萄糖、熊果酸、牛血清蛋白对照品、麦角甾醇对照品；
酚蛋白定量试剂盒，5% 香草醛-冰乙酸，苯酚，无水乙醇、丙酮、浓硫酸(分析纯)，乙腈(色谱纯)。
供试样品 ：不同品种的灵芝样品采集或购买。
2、总多糖含量测定
2. 1 供试品溶液的制备 称取灵芝子实体干燥粗粉 1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入 80% 的无水乙醇 100 mL，85 ℃ 回流提取 2 次，每次 0. 5 h，过滤弃去滤液，加蒸馏水 100 mL，100 ℃ 回流提取 2次，每次 1 h，过滤，合并滤液，定容至 250 mL 量瓶中，摇匀，即得。
2. 2 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的 D-无水葡糖糖对照品 10. 0 mg 于 100 mL 量瓶中，加蒸馏水配制成 0. 10 g·L－1 的对照品溶液，置冰箱中备用。
2. 3 标准曲线的绘制
精密吸取葡萄糖对照品溶液 0. 3，0. 6，0. 9，1. 2，1. 5，1. 8 mL 分别置于具塞试管中，加蒸馏水至 2. 0 mL，摇匀后置冰浴中加入5% 的苯酚溶液 1 mL、浓硫酸溶液 5 mL，摇匀，静置5 min，于沸水浴中加热 15 min，冷却至室温，以蒸馏水 2. 0 mL 为空白，同法操作，于 490 nm 波长处测定其吸光度 。以质量浓度(C)为横坐标，A 为纵坐标绘制标准曲线。
2. 8 样品含量测定
分别取样品，按 2. 1. 1制备供试品溶液，平行 3 份。精密吸取 2 mL 至试管中，按 2. 1. 3 测定其吸光度。
3、总三萜含量测定
3. 1 供试品溶液的制备
称取灵芝子实体干燥粗粉 1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入无水乙醇50 mL 浸泡 1 h 后回流 2 h，放冷后补足差重，过滤、取续滤液，即得。
3. 2 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的熊果酸对照品 10. 0 mg 置 50mL量瓶内，加无水乙醇配制成 0. 2 g·L－ 1的对照品 溶 液，置 冰 箱中备用。
3. 3 标准曲线的绘制
精密吸取熊果酸对照品溶液 0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 2 mL 分别至试管中，100 ℃ 水浴蒸干后加入 5% 的香草醛-冰醋酸溶液0. 5 mL，摇匀，加入高氯酸溶液 0. 8 mL，60 ℃ 水浴20 min，取出后于冰浴中加入冰乙酸 5 mL，摇匀，室温放置 15 min。以无熊果酸对照品溶液的试管为空白，同法操作，于 548 nm 条件下测定吸光度。以熊果酸质量(X) 为横坐标，吸光度(Y) 为纵坐标绘制 标 准 曲 线。
3. 4 样品含量测定
分别取样品，按制备供试品溶液，平行3份。精密吸取 0. 5 mL至试管中，测定其结果。
4、 蛋白质含量测定
4. 1 供试品溶液的制备
称取灵芝子实体干燥粗粉 1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水100 mL，超声提取 10 min，补足差重，摇匀，过滤取续滤液适量，于离心管中以 8 000 r·min－ 1 离心 15 min，取上清液，即得。
4. 2 对照品溶液的制备
准确称量牛血清蛋白对照品 5 mg，配成质量浓度为 0. 25 g·L－ 1的牛血清蛋白对照品溶液，置冰箱中备用。
4. 3 标准曲线的绘制
精密吸取对照品溶液0. 1，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0 mL 于试管中，加蒸馏水至 1 mL，摇匀。分别在试管中加入试剂盒中的试剂甲 5 mL，摇匀，于室温放置 10 min;加入试剂乙 0. 5mL，立即摇匀，于室温保温 30 min 后于 750 nm 波长处测定其吸光度。以 1 mL 蒸馏水为空白，同法操作。以蛋白质质量浓度为横坐标(C)，吸光度为纵坐标(A)绘制标准曲线。
4. 4 样品含量测定
分别取样品，按制备供试品溶液，平行3 份。精密吸取 1. 0 mL 至试管中，测定其吸光度值，计算结果。
5、麦角甾醇含量测定
灵芝子实体中麦角甾醇含量测定采用高效液相色谱仪，色谱柱为C18 (4. 6mm × 250mm，5 μm)，流动相 100% 甲醇，流速 0. 8mL·min－ 1 ，检测波长 282 nm 。对照品和供试品色谱图见图 1。
高效液相色谱仪测定灵芝中活性成分含量
高效液相色谱仪测定灵芝中活性成分含量
高效液相色谱仪测定灵芝中活性成分含量
高效液相色谱仪测定灵芝中活性成分含量