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高效液相色谱仪检测发酵豆腐制品中的生物胺含量

高效液相色谱仪检测发酵豆腐制品中的生物胺含量

本文采用高效液相色谱仪同时检测发酵豆制品中10种生物胺（BAs）的含量，并测定一些发酵豆腐制品中的生物胺含量。

一、材料与仪器

1、试剂与样品

标准品腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、 2- 苯乙胺、组胺、酪胺、胍基丁胺、苯甲酰氯、庚胺，纯度均在 97% 以上；

5- 羟基色胺，纯度 98%；

乙腈，色谱级；

纯净水；

其它试剂均为分析纯级。

臭豆腐干样品；白方、红方、青方腐乳。

2、仪器

高效液相色谱仪配紫外检测器；

高速电动匀浆器；

大容量离心机。

二、试验方法

1、标准溶液的配制

各标准品用 0.1 mol/L HCl 溶液配制成质量浓度为 1 mg/mL 的储备液，分别取相同体积的10种生物胺储备液（腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、2- 苯乙胺、组胺、 5- 羟基色胺、酪胺和胍基丁胺），混匀得到质量浓度为 100 μg/mL 的混合标准品工作液。

1 mg/mL 内标庚胺储备液用 0.1 mol/L HCl溶液稀释成质量浓度为 100 μg/mL 的内标工作液。所有溶液均避光保存于 4 ℃ 冰箱中。

2、标准曲线的制作

100 μg/mL生物胺混合标准品工作液用 0.1mol/L HCl溶液稀释至 80 、 50 、 20 、 10 、 5 、 1 、 0.5 、 0.1μg/mL。

衍生过程的具体方法是：分别取 2 mL不同浓度的稀释液，同时添加 100 μL 100 μg/mL内标工作液， 1 mL 2 mol/L NaOH ， 10 μL 苯甲酰氯，然后旋涡振荡 30 s ，在 30 ℃ 水浴条件下反应40 min ，反应 20 min 时取出并漩涡振荡 30 s 。

反应结束后加 2 mL 饱和 NaCl 溶液终止反应。然后加入 3 mL 乙醚萃取， 1 000×g 离心 10 min ，移取乙醚层，重复此萃取过程。乙醚层合并于规格为10 mL 的离心管中，氮气吹干，然后用 1 mL 乙腈（色谱级）溶解， 0.45 μm 偏氟膜过滤，待测。每个样品做 3 个平行。样品避光保存于 4 ℃ 冰箱中，24 h 内完成检测。

3、样品的前处理

将样品用研钵研磨均匀，称取 5.0 g 置于 50mL 离心管中，加 250 μL 内标（ 1 000 μg/mL 庚胺储备液），再加 20 mL 0.4 mol/L 高氯酸溶液分散，均质 1 min ，振荡提取 5 min ，静置 5 min ，然后5000×g 离心 35 min ；将上清液移入 50 mL 容量瓶中，用 20 mL 高氯酸溶液重复提取 1 次，上清液合并至相应容量瓶中，用 0.4 mol/L 高氯酸溶液定容至刻度；取 2 mL 该溶液，按标准品的衍生方法处理。本试验中对每个样品的处理均重复 3 次。

4、色谱条件

色谱柱：ODS-3 250 mm×4.6 mm ， 5μm ；

柱温： 30 ℃ ；

流动相 A ： 0.01 mol/L 乙酸铵溶液；

流动相 B ：乙腈；

流动相梯度洗脱方法见表 1 ；

进样量： 20 μL ；

紫外检测波长： 254 nm ；

色谱工作站。

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