描述

PP1 是一种有效的选择性 Src 家族抑制剂，抑制 Lck 和 Fyn，IC50 分别为 5 和 6 nM。

相关类别

信号通路 >> 蛋白酪氨酸激酶 >> SRC

研究领域 >> 癌症

靶点

IC50: 5 nM (Lck), 6 nM (Fyn), 250 nM (EGFR), >50 μM (JAK2)[1]

体外研究

PP1在体外抑制Lck（IC50 = 5 nM）和FynT（IC50 = 6 nM），浓度显着低于抑制ZAP-70（IC50>100μM），JAK2（IC50>50μM），EGFR激酶，蛋白激酶A.PP1抑制用抗CD3和促分裂原刺激的T细胞中的全���胞酪氨酸磷酸化和增殖。 PP1在人T细胞中选择性抑制IL-2基因表达而不是GM-CSF和IL-2R基因诱导[1]。

激酶实验

将蛋白A-Sepharose珠（制备为50％（w / v）悬浮液）以250μL/ mL添加至抗体/裂解物混合物中，并使其在4℃下孵育30分钟。然后将珠子在1mL裂解缓冲液中洗涤两次，并在1mL激酶缓冲液（25mM HEPES，3mM MnCl 2,5mM MgCl 2和100μM原钒酸钠）中洗涤两次，并重悬于50％（w / v）in激酶缓冲液。将25微升珠子悬浮液与适当浓度的化合物和[γ-32P] ATP（25μL/孔，200μCi/ mL）一起加入到包被烯醇酶的96孔高蛋白结合板的每个孔中。激酶缓冲液中的溶液）。在20℃温育20分钟后，向测定孔中加入60μL含有10mM ATP的沸腾2×溶解缓冲液以终止反应。从孔中取出30微升样品，煮沸5分钟，并在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。随后将凝胶干燥并暴露于Kodak X-AR膜。为了定量，使用Molecular Dynamics激光扫描仪扫描胶片，并确定主要底物带，烯醇化酶p46的光密度。引起50％烯醇酶磷酸化抑制的化合物浓度（IC 50）由密度与化合物浓度的关系图确定。在用于测量化合物对Lck的活性的伴随实验中，使用50mM EDTA，1mM ATP在Skatron收获机上用两个洗涤循环洗涤测定板。然后将闪烁液（100μL）加入孔中，并使用Pharmacia Biotech micro-β计数器测量P掺入。引起50％酶活性抑制的化合物浓度（IC50）由酶活性抑制百分比对化合物浓度的图谱确定[1]。

细胞实验

如下测量纯化的人外周血T细胞中抗CD3刺激的酪氨酸磷酸化的抑制。所有孵育均在37℃下在Eppendorf Thermomixer 5436中以11的混合设置进行。将细胞（1×106在100μLRPMI1640培养基中）与药*物一起孵育15分钟，然后与6孵育6分钟。 μg抗CD3 / mL（抗leu4,100μg/ mL）。*终反应体积为115μL。通过加入57.5μL3x溶解缓冲液终止反应，所述缓冲液在100℃温育，然后加入。将样品混合，煮沸5分钟，并储存在-70℃。用多克隆抗磷酸酪氨酸抗体探测在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行的这些细胞裂解物的Western印迹，并用I标记的蛋白A（ICN）检测免*疫复合物。为了定量，使用Molecular Dynamics激光扫描仪扫描胶片，并且在抗CD3存在下（在存在和不存在药*物的情况下）定量主要底物条带p70的光密度。抑制百分比计算如下：（1-（药*物存在下p70光密度单位/不存在药*物时p70单位））×100。 IC50等于测量50％抑制的化合物浓度[1]。

参考文献

[1]. Hanke JH, et al. Discovery of a novel, potent, and Src family-selective tyrosine kinase inhibitor. Study of Lck- and FynT-dependent T cell activation. J Biol Chem. 1996 Jan 12;271(2):695-701.

1-(tert-Butyl)-3-(p-tolyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

3-(4-Methylphenyl)-1-(2-methyl-2-propanyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

1-tert-butyl-3-(4-methylphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

1H-Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine, 1-(1,1-dimethylethyl)-3-(4-methylphenyl)-

4-Amino-5-(methylphenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo-(3,4-d)pyrimidine

1H-Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine (1-(1,1-dimethylethyl)-3-(4-methylphenyl)

1-tert-butyl-3-(4-methylphenyl)-1h-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

pp1