PCR实验方法步骤:
实验过程: 一、试剂准备 1. DNA模板 2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μl Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。 3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。 三、注意事项 1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。 2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。 3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 4.PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤高压。 5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。 6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压。 7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。 小鼠血管抑素(mouse Angiostatin) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠载脂蛋白E(mouse APO E) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠B细胞刺激因子(mouse BAFF) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠凋亡因子BAX(mouse BAX) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠细胞凋亡相关基因(mouse BCL-2) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠脑衍化神经营养因子(mouse BDNF) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠脑衍化神经营养因子受体(mouse BDNF R) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠骨成型蛋白-2(mouse BMP-2) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠骨成型蛋白-4(mouse BMP-4) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠骨成型蛋白受体1A(mouse BMP-R1A) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠骨成型蛋白受体Ⅱ(mouse BMP-R2) ELISA 48T/96T 进口分装 小鼠脑钠肽(mouse BNP) ELISA 48T/96T 进口分装