流感病毒N5亚型试剂盒荧光PCR法

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

人心脏微血管内皮细胞总RNAHCMEC NA1,3-双(氯甲基)四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))质量规格：>95.0%(GC)1,3-Bis(chloromethyl)tetramethyldisilazane

ZR75-30细胞，人癌细胞 129小鼠ES细胞,E14细胞 HNE2, 人鼻咽癌细胞系1,3-二苯基四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))质量规格：>95.0%(GC)Tetramethyl-1,3-diphenyldisilazane

MX-1(人癌细胞) 5×106cells/瓶×2N-亚硝基-N-甲基尿烷(>95.0%(GC))质量规格：>95.0%(GC)N-Methyl-N-nitrosourethane

HDMEC Pellet 人微血管内皮细胞团块(少年者) > 1 mio.cells 成纤维细胞培养基FM-prfMUG;4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸质量规格：>98%,BR4-MUG

CL-0373KiMA(人胚肾上皮细胞系)5×106cells/瓶×2米诺地尔质量规格：>98%Minoxidil
3T3-L1, 小鼠前脂肪细胞 MouseD-氨基葡萄糖盐酸盐D-Glucosamine 质量规格：>98.5%,BR

TNFRSF10A Others Human 人 TNFRSF10A / CD261 / APO2 人细胞裂解液 (阳性对照) 奥卡西平Oxcarbazepine质量规格：≥99.0%,BR

人肝癌细胞;SMMC-7721奥卡西平（标准品）Oxcarbazepine质量规格：HPLC>99%,标准品

3. 毛发细胞系统金丝桃素(标准品)Hypericin质量规格：HPLC≥98%,标准品

小鼠神经干细胞D-葡萄糖-6-1酸D-（+）-Glucopyranose 6-phosphate质量规格：1M in H2O(260Mg/ml),进口原装
NIH:OVCAR-3细胞，卵巢癌细胞 人食管癌细胞,KYSR450细胞 豚鼠皮肤细胞;GP-S22',3'-O-异亚丙级-6-核苷嘌呤质量规格：美国进口2',3'-O-Isopropylidene-6-mercaptopurine riboside

tTA基因修饰的小鼠畸胎瘤细胞(B类);F9-CAG-tTA-3A12-氨基-6-羟基-8-嘌呤质量规格：美国进口2-Amino-6-hydroxy-8-mercaptopurine

HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/Vietnam/1194/2004) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) 2-氨基-6-嘌呤-9-D-核苷水合物质量规格：美国进口2-Amino-6-mercaptopurine-9-D-riboside Hydrate

人心肌细胞-RNAHCM-a miRNA5 μgS-甲基-3-硫代对乙酰氨基酚质量规格：美国进口S-Methyl-3-thioacetaminophen

HEPACAM2 Others Rat 大鼠 HepaCAM2 人细胞裂解液 (阳性对照) 2-羟基奈韦拉平质量规格：美国进口2-Hydroxy Nevirapine
CLEC4A2 Others Rat 大鼠 CLEC4A2 / DCIR 人细胞裂解液 (阳性对照) RNase&DNase剂shēng huà shì jì容量：25克

心脏微血管内皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)二二醇单迷 2-(2-Mqthoxyqthoxy)qthcnol 111-77-3

流感病毒N5亚型试剂盒荧光PCR法Dami细胞，人巨核细胞保白血病细胞 小鼠网织细胞肉瘤,M5076细胞 前列腺上皮细胞生长添加物PEpiCGS邻本二酸二正辛酯shēng huà shì jì容量：500克

NCI-H2227(人小细胞肺癌细胞) 5×106cells/瓶×2CTX头孢霉素1克BR，17Tabor u/mg

BSC-1(猴肾细胞) 5×106cells/瓶×2 CM-M062小鼠肾小管上皮细胞完全培养基100mL 人前列腺癌细胞;PC-3 [PC3]Locustbeangum 25g/100g/500g原装 Sigma G0753