甲3亚型流感病毒试剂盒荧光PCR法

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
小鼠T细胞瘤细胞;Cyc-Tag(S49)3,3,5-三-L-甲状腺原氨酸，塞罗宁质量规格：>97%,BR3,3',5'-Triiodo-L-thyronine

人脂肪细胞-内脏(HPA-v)(1×106 )Corylifol A(标准品)质量规格：HPLC≥98,标准品Corylifol A

CM-R088大鼠破骨细胞完全培养基100mL溴芬酸钠质量规格：>98%,BRBromfenac

小鼠肺腺癌细胞系;LA795 小鼠食管平滑肌细胞完全培养基 100mL溴芬酸钠(标准品)质量规格：HPLC≥99,标准品Bromfenac

小鼠成纤维细胞(EGFP标记) Mouse对香豆酸;对羟基肉桂酸(标准品)质量规格：HPLC≥98%，标准品p-Coumaric acid
Acc-3细胞，涎腺腺样囊性癌细胞 人胃癌细胞,BSG823细胞 犬胸腺细胞;cf2Th苯噻啶Pizotifen质量规格：美国进口

tTA基因修饰的小鼠畸胎瘤细胞(B类);P19-CAG-tTA-1D3普伐他汀Pravastatin质量规格：美国进口

HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/turkey/Turkey/1/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) 3-α-羟基普伐他汀内酯3α-Hydroxy Pravastatin Lactone质量规格：美国进口

人骨骼肌细胞HSkMC3-α-羟基普伐他汀钠盐3α-Hydroxy Pravastatin  Salt质量规格：美国进口

CSF2 Others Mouse 小鼠 GM-CSF / CSF2 人细胞裂解液 (阳性对照) (S)-3’’-羟基普伐他汀钠盐(S)-3’’-Hydroxy Pravastatin  Salt质量规格：美国进口
CL-0431RT4(人膀胱移行细胞瘤细胞)5×106cells/瓶×2正戊100克RT，避光

人细胞;Hela S3 [HeLaS3] 大鼠大隐静脉平滑肌细胞完全培养基 100mL言醋录普鲁卡应 Chloroproccinq xy7nochloridq 3828-89-7

AtT20 小鼠垂体瘤细胞阿拉伯树胶粉 Gum arabic from acacia tree 9000-1-5 100G 通用试剂

VSIG4 Others Human 人 VSIG4 人细胞裂解液 (阳性对照) 肌动蛋白(广谱)阳性对照片100克RT

人癌细胞;MDA-MB-435S(1,4-Dithioerythritol)
肝内胆管上皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)Glycogenfrombovineliver糖原九型100毫克超，99%

HA Others H9N2 甲型流感 H9N2 (A/Hong Kong/35820/2009) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 布涤奈德 Budqsonidq 21333--3

人T瘤细胞Jurkat亚系;Jurkat77地衣红 Orcein (certified by the Biological St... 1400-62-0 1G 染色剂

豚鼠胚胎细胞;104C1 貂肺上皮细胞，Mv.1.Lu细胞 GT1-1细胞，小鼠垂体瘤细胞wo7iumchromatetetrahydrate四水二钠100克GR，99.5%

人肝细胞;QSG-7701 [QSG7701]对甲基本硫酚p-toluethiol
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
甲3亚型流感病毒试剂盒荧光PCR法（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

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