丙型流感病毒试剂盒荧光 PCR 法

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

中国仓鼠卵巢细胞(亚系克隆);CHO-HCV-p7D-泛酸钠质量规格：>98%,BR D-pantothenate

ANGPT4 Others Human 人 Angiopoietin 4 / ANG4 / ANGPT4 人细胞裂解液 (阳性对照) 依度沙班;伊多塞班质量规格：>99%,BREdoxaban

人内皮细胞完全培养基 100mL牛防风素;6-甲氧基当归素质量规格：HPLC>97%Sphondin

HS-1细胞，人皮肤癌细胞系 滑 小鼠胰腺癌细胞(B类);Pan026-羟基(标准品)质量规格：>98%(GC),标准品6-Hydroxycoumarin

CCL20 Protein Human 重组人 CCL20 / MIP-3 alpha 蛋白 (His 标签)头孢匹林钠 质量规格：Content 96.0-102.0%,BRCefapirin
CD79B Others Rat 大鼠 CD79B / B29 人细胞裂解液 (阳性对照) 稻瘟灵（标准品） Isoprothiolane质量规格：分析标准品,97.5%

人椎间盘髓核细胞完全培养基 100mL咪唑乙烟酸（标准品）Imazethapyr质量规格：分析标准品,98.5%

VERO C1008 (E6)细胞，非洲绿猴肾细胞 CHO/dhFr-(中国仓鼠二氢叶酸还原酶缺陷细胞) 小鼠T瘤细胞(鸡OVA基因修饰);E.G7-OVA异丙隆（标准品） Isoproturon solution质量规格：分析标准品,99.5%

EFNB2 Protein Canine 重组狗 Ephrin-B2 / EFNB2 蛋白 (His 标签)甲咪唑烟酸（标准品） Imazapic质量规格：分析标准品

V79(仓鼠肺细胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠前胃癌细胞;MFC异标准溶液（10μg/ml,u=6%）Iprobenfos standard solution质量规格：10μg/ml,u=6%
猫肾细胞;CRFK三扶乙酰shēng huà shì jì容量：RT1克

人APP基因转染CHO细胞株;7WD10 食管癌细胞，Eca-109细胞 IBRS-2细胞，猪肾细胞系2,6-二溴本醌-4-录亚安 2,6-DIBROMOinoneONq-4-CHLOROIMIDq 237-42-1

人胚肺成纤维细胞;MRC-5软海绵酸，英文名或英文缩写：OA，级别：BR，58-60℃，规格：25克

HA Others H15N8 甲型流感 H15N8 (A/duck/AUS/341/1983) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人细胞裂解液 (阳性对照) 正十二烷，英文名或英文缩写：Dodecane，级别：AR，98%，规格：20毫克

人脑血管平滑肌细胞RNAHBCSMC miRNA5 μg2521-84-8L-环戊基甘酸L-CYCLOPENTYL GLYCINE
人胚肺成纤维细胞;HFL1基霉素，英文名或英文缩写：Valinomycin，级别：USP级,γ-射线，10mg/ml，规格：1克

CD200R1L Others Human 人 CD200R1L / CD200R2 / CD200RLa 人细胞裂解液 (阳性对照) 联本安流醋盐;流醋联本安;联本安化流醋 Bqnzidinq sulfctq 231-86-

角膜上皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)2′-脱氧腺苷-5′-二嶙酸三钠盐，英文名或英文缩写：dADP，3Na，级别：高，97%，规格：300u

CST7 Others Mouse 小鼠 Cystatin 7 / CST7 人细胞裂解液 (阳性对照) 石灰，英文名或英文缩写：Calcium oxide，级别：CP，规格：50毫克

大鼠冠状动脉平滑肌细胞完全培养基 100mL(抑蛋白酶肽,抑肽酶)
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
丙型流感病毒试剂盒荧光 PCR 法三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。