诺如病毒GⅡ型试剂盒荧光PCR法

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
小鼠周神经成纤维细胞(MPNF)(5×105) HL-60, 人早幼粒白血病细胞 Human氧化偶氮苯-4,4'-二羧酸二乙酯(>97.0%(GC))质量规格：>97.0%(GC)Diethyl Azoxybenzene-4,4'-dicarboxylate

中国仓鼠肺细胞;CHL4,4'-双(己氧基)氧化偶氮苯(>96.0%(N))质量规格：>96.0%(N)4,4'-Bis(hexyloxy)azoxybenzene

人髓核细胞(HNPC)(5×105)4,4'-二戊氧基氧化偶氮苯(>95.0%(N))质量规格：>95.0%(N)4,4'-Diamyloxyazoxybenzene

CL-0083FaDu(人咽鳞癌细胞)5×106cells/瓶×24,4'-二丁氧基氧化偶氮苯质量规格：4,4'-Dibutoxyazoxybenzene

小鼠垂体瘤细胞;GT1-1 大鼠角膜成纤维细胞完全培养基 100mL水杨酸（标准品）质量规格：含量测定Salicylic acid
Hep 3B(人肝癌细胞) 5×106cells/瓶×2垂体腺苷酸环化酶激活肽-27，人，小鼠，绵羊，猪，大鼠PACAP-27 (human, mouse,ovine, porcine, rat)质量规格：>95%,BR

AGRP Others Human 人 AgRP 人细胞裂解液 (阳性对照) 垂体腺苷酸环化酶激活肽-27（6-27），人，鸡，小鼠，猪，大鼠PACAP-27 (6-27) (human,chicken, mouse, ovine,porcine, rat)质量规格：>95%,BR

人角膜上皮细胞HCEpiC垂体腺苷酸环化酶激活肽-38（16-38），人，鸡，小鼠，绵羊，猪，大鼠PACAP-38 (16-38) (human,chicken, mouse, ovine,porcine, rat)质量规格：>95%,BR

SECTM1 Others Human 人 SECTM1 / K12 人细胞裂解液 (阳性对照) 垂体腺苷酸环化酶激活肽相关肽（1-29），大鼠PACAP-Related Peptide (1-29)(rat)质量规格：>95%,BR

HMy2.CIR 人 B 母细胞胰多肽，人Pancreatic Polypeptide,human质量规格：>95%,BR
CD93 Others Human 人 CD93 / C1QR1 人细胞裂解液 (阳性对照) PEPSTATIN胃蛋白酶抑制剂超级白色粉末COLDsigma

MS751 人颈表皮癌细胞3-羌基炳晴puriss》99.0% 3-xy7noxypropionitnilq 109-78-4

NCI-H661人大细胞肺癌细胞 NCI-H661 large cell lung cancer cell RPMI-1640(GIBCO)+10%FBSpxenOLPHTHALEIN酚酞白色至米白色固体RTsigma

AIMP1 Protein Human 重组人 AIMP1 / EMAP2 / SCYE1 蛋白 (His 标签)PROTEINMWMARKER,HIGHRANGE蛋白Marker生物技术级液体FROZENsigma

人胚肺二倍体细胞;2BS 人前列腺成纤维细胞完全培养基 100mL9004-34-6微晶纤维素Microcrystalline Cellulose (AS)
LTBR Others Rat 大鼠 LTBR / TNFRSF3 人细胞裂解液 (阳性对照) BEEFEXTRACTPOWDER牛肉浸粉**棕黄色至褐色粉末RT不sigma

绿色荧光蛋白标记人胃癌细胞;MGC803-GFP1-二基安基-2-炳醇 1-Dimqthylcmino-2-propcnol 108-16-7

786-O细胞，人肾透明细胞腺癌细胞 小鼠结肠癌细胞,CMT93细胞 CL-0202Saos-2(人骨肉瘤细胞)5×106cells/瓶×2D-FRUCTOSED-果糖美国药典级,欧洲药典级白色精细粉末RTsigma

VCaP(人前列腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2化高铁血红蛋白参比液150g50张

NHEM.f-c M2 正常人表皮素细胞(NHEM)少年，M2培养液中培养 500,000cells 视网膜微血管内皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)Uracil 50g/100g/250g/500g原装 Amresco 0847
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
诺如病毒GⅡ型试剂盒荧光PCR法（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。