小双节RNA病毒试剂盒荧光PCR法

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
WISH细胞，人羊膜细胞 普通变形杆菌 中国仓鼠卵巢细胞(亚系克隆);CHO DUX B11 Carrying pBSCRLc/pTCSgpt clone 35.6草(>98%,BR)质量规格：>98%，BROxalyldihydrazide

CXCL9 Protein Cynomolgus 重组食蟹猴 CXCL9 / MIG / C-X-C motif chemokine 9 蛋白恶唑(>96%，BC)质量规格：>96%，BCOxazole

NCI-H292(人肺癌细胞) 5×106cells/瓶×2 甲型流感 H5N1 (A/bar-headed goose/Qinghai/1A/2005) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人细胞裂解液 (阳性对照) 乙酸钯质量规格：BCPalladium (II) acetate

小鼠诱导性多潜能干细胞;PUMC-mips-D2氯化钯质量规格：BCPalladium (II) chloride

ALOX15B Others Human 人 ALOX15B / 15 Lipoxygenase 2 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 邻苯二甲腈(>99.0%(GC))质量规格：>99.0%(GC)Phthalonitrile
hFOB 1.19(SV40转染人成骨细胞) 5×106cells/瓶×2 产气肠杆菌D-色氨酸D-Tryptophan质量规格：>98%,BR

膀胱上皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)D-半乳糖胺盐酸盐D(+)-Galactosamine 质量规格：BR,98%

TSPAN8 Others Human 人 TSPAN8 / Teaspanin 8 / TM4SF3 人细胞裂解液 (阳性对照) 薯蓣皂苷;重楼皂苷III(标准品)Dioscin质量规格：HPLC≥98.0%,标准品

人成骨肉瘤细胞;Saos-2薯蓣皂甙Dioscin质量规格：BR，含量≥95.0%

AD293细胞，人胚肾细胞 牛胚气管细胞,EB(NBL-4)细胞 CL-0303PATU8988(人胰腺癌细胞)5×106cells/瓶×2薯蓣皂素(标准品)Diosgenin质量规格：HPLC>98.0%,标准品
EPCAM Others Human 人 EpCAM / OP1 人细胞裂解液 (阳性对照) Antipaindixy7nochloride抗痛素100克生物技术级，600u/mg

人肝内胆管上皮细胞总RNAHIBEpiC NA啊匹油脂 L cPIqZON GRqcSq L 1678-0-3

PAK3 Others Human 人 PAK3 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) Sulforhodaminep磺酰罗丹明B细胞培养试剂染料100毫克BS

中国仓鼠卵巢细胞;TPO-CHO-IBOVINESERUMALBUMIN,20%SOLUTION牛血清白蛋白溶液生物技术级500MLCOLD

SMC-1细胞，胸膜细胞瘤 早幼粒急性白血病细胞系,HL-60细胞 小鼠子细胞;U14(化琼脂)
786-0 人肾透明细胞腺癌细胞PEPTONE140蛋白胨 140学级浅棕色到棕色粉末RT不sigma

Hep G2人肝癌细胞 Hep G2 human hepatocarcinoma cells DMEM+10% FBS溴柏里酚蓝;溴麝香草酚蓝;溴柏里香酚蓝;3′,3″-二溴麝香草酚磺酞 BroMothyMol bluq 76-29-2

PDGFC Protein Mouse 重组小鼠 PDGF-C / SCDGF 蛋白 (Fc 标签)聚酮 Polyvinylpyrrolidone 10 (PVP10) 9003-39-8 25G 染色剂

人支气管上皮细胞(HBEpiC)(5×105 ) 细胞名称 种属β-caroteneβ-叶红素250毫克IND

豹猫肺成纤维样细胞;LCL44648-54-8叠氮化基硅烷 (TMSiA)Azidotrimetxylsilane
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
小双节RNA病毒试剂盒荧光PCR法设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。