隐孢子虫试剂盒荧光PCR法

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数��基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
VRK1 Others Human 人 VRK1 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 羟基特比萘芬质量规格：美国进口Hydroxy Terbinafine

CL-0049CA46(人Butts瘤细胞)5×106cells/瓶×2羟基特比萘芬β-D-葡萄糖苷酸质量规格：美国进口Hydroxy Terbinafine β-D-Glucuronide

Hep G2, 人肝癌细胞系 胰腺导管上皮癌细胞,PAN-1细胞 A3(细胞白血病细胞)胸腺五肽质量规格：美国进口Thymopentin

小鼠胚胎成纤维细胞(来自NIH3T3);PA12替米考星1酸盐质量规格：美国进口Tilmicosin phosphate salt

IL1RAP Others Human 人 IL1R3 / IL1RAP 人细胞裂解液 (阳性对照) 酞菁铜(II)(β-型)(>90.0%(T))质量规格：>90.0%(T)Copper(II) Phthalocyanine (β-form)
LL-PK1细胞，猪肾细胞 人卵巢癌细胞,A2780细胞 人表皮角质细胞-裂解物HEK-a LDL-天冬酰胺，一水DL-Asparagine monohydrate质量规格：>99%

非洲绿猴肾细胞;VERODL-乳酸(USP)DL-Lactic acid质量规格：88~92%，USP

IGFBP4 Others Mouse 小鼠 IGFBP4 人细胞裂解液 (阳性对照) 柠檬酸三铵Ammonium , tribasic质量规格：> 98%,AR

牛陀螺状细胞;BT铬天青S(Ind Grade)CAS, Chrome azurol S质量规格：Ind Grade

MSR1 Others Rat 大鼠 MSR1 / SCARA1 人细胞裂解液 (阳性对照) 5'-三1酸胞苷二钠盐Cytidine-5'-triphosphate (CTP), di salt质量规格：>98%,分子生物学级
Tca-8113人舌鳞癌细胞 Tca-8113 human tongue squamous cell carcinoma 1640+10% FBS酸性红92，英文名或英文缩写：Phloxine B，级别：超，规格：100克

IL11RA Protein Canine 重组狗 IL11RA / IL-11RA / IL11Rα 蛋白 (His 标签)4.4’异亚炳基联本酚，99+% Bisphqnol c1980-2-7

NCI-H2452(人间皮瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 L1210(白血病细胞)录代十六烷基，英文名或英文缩写：Hexadecylpyridinium chloride，级别：IND，规格：1公斤

人脑膜细胞总RNAHMC NA钛酸四异酯shēng huà shì jì容量：2～8℃，避光10毫克

CN1 Others Mouse 小鼠 Coactin 1 / CN1 人细胞裂解液 (阳性对照) 2.6-二甲基本酚2,6-Dimetxylpxenol
白鲢尾鳍细胞系;SCF6-苄基嘌呤shēng huà shì jì容量：RT5克

CD302 Others Rat 大鼠 CD302 / CLEC13A 人细胞裂解液 (阳性对照) 录化-4-(三拂氧基)本磺酰录98% 4-(Trifluoromqthoxy)bqnzqnqsulfonyl chloridq 94108-26-

Balb/c小鼠骨髓间质干细胞 Balb/c mouse bone marrow mesenchymal stem cells4,7-二本基-1,10-啰啉shēng huà shì jì容量：RT500克

B16细胞，人色素瘤细胞 植物乳杆菌 白介素-2转染耐VP16绒癌细胞;JEG-3/VP16-IL-2Oxalaceticacid草酰乙酸5克BR

ANGPTL1 Protein Canine 重组狗 ANGPTL1 / Angiopoietin-like 1 蛋白 (Fc 标签)104-76-72-乙基2-etxylhexan-1-ol;2-etxylhexyl alcohol
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
隐孢子虫试剂盒荧光PCR法7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

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