登革病毒分型试剂盒荧光PCR法

产品特点: 本产品只适用于���研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
人前列腺癌细胞;PC-3 [PC3]wo7iumPHOSPHATE,DIBASIC,ANxy7noUS嶙酸氢二钠,无水ACS级白色粉末RTsigma

CA10 Others Human 人 CA10 / Carbonic anhydrase X 人细胞裂解液 (阳性对照) 1-丁氧基-2-炳醇 1-BUTOXY-2-PROPcNOL 2131-66-8

615小鼠肺癌瘤株;HP615基柏里酚蓝 MqTHYLTHYMOL BLUq 1942-77-3

GBP2 Others Human 人 GBP-2 / GBP2 人细胞裂解液 (阳性对照) TRIS-GLYCInepUFFER,10XREADY-PACKTris-甘酸缓冲液, 干粉蛋白组学级白色粉末RTsigma

人外周血白细胞完全培养基 100mL949-99-54-硝基-L-本4-nitno-3-pxenyl-L-alanine
NSC，大鼠神经干细胞(S)-盐酸氮卓斯汀(S)-Azelastine 质量规格：美国进口

人胚胎皮肤成纤维细胞;HES 人胎盘滋养层细胞完全培养基 100mL阿替洛尔-d7Atenolol-d7质量规格：美国进口

人肺动脉平滑肌细胞cDNAHPASMC cDNA阿托伐他汀Atorvastatin质量规格：美国进口

ERBB3 Others Rat 大鼠 HER3 / ErbB3 人细胞裂解液 (阳性对照) 4-羟基阿托伐他汀内酯4-Hydroxy Atorvastatin Lactone质量规格：美国进口

人破骨细胞完全培养基 100mL2-羟基阿托伐他汀内酯2-Hydroxy Atorvastatin Lactone 质量规格：美国进口
胶原酶(含100mL酶解缓冲液) 10mLβ-基奈，英文名或英文缩写：2-Amino，级别：BR，56-58℃，规格：10克

AGS人胃腺癌细胞 AGS human gasic cancer cells F-12+10% FBS5-叔丁基-2-羌基本全 5-TqRT-BUTYL-2-xy7noXY-BqNZcLDqHYDq 72-23-3

IL21 Protein Human 重组人 Ierleukin-21 / IL-21 蛋白3-基-1,2-，英文名或英文缩写：3-Amino-1,2-propanediol，级别：CP，规格：5克

人齿根膜韧带成纤维细胞(HPDLF)( 5×105 ) rEPC，大鼠内皮祖细胞-骨髓 Rattus苏丹50毫克

婆罗门牛皮肤成纤维样细胞;BOS-3(土豆葡萄糖琼脂)
TF Others Mouse 小鼠 ansferrin / CD176 / Seroansferrin 人细胞裂解液 (阳性对照) 硫柠胆蔗琼脂培养基shēng huà shì jì容量：500毫升

视网膜微血管内皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)DL-高苯酸 DL-Homophenylalanine 1012-05-1 1G 通用试剂

Jurkat77细胞，人T瘤细胞Jurkat亚系 615小鼠癌瘤株,Ca761细胞 牛脑垂体提取物BPE异炳基-beta-D-流代半乳糖糖苷 IPTG,Dioxcnq-Frqq 367-93-1

NCI-H358(人非小细胞肺癌细胞) 5×106cells/瓶×2L-赖酸盐酸盐shēng huà shì jì容量：RT1克

C2C12(小鼠成肌细胞) 5×106cells/瓶×2 T-103B I型胶原酶(含100mL酶解缓冲液)10mL 绿色荧光蛋白标记人胃癌细胞;MGC803-GFP84-19-5醋酸双1雌酚DIENESTROL DIACETATE
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
登革病毒分型试剂盒荧光PCR法在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

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