西尼罗病毒试剂盒荧光PCR法

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

动物上皮细胞生长添加物-aEpiCGS-2-a盐酸头孢他美酯(标准品)质量规格：效价测定Cefetamet pivoxil

荷兰白花奶牛牛肺细胞;DCL1 肺腺癌细胞，SPA-A1细胞 SCaBER(膀胱鳞癌细胞)L-生物喋呤质量规格：>98%,BRL-Biopterin

EB病毒转化的人B细胞;KM0501渥曼青霉素质量规格：>98%,美国进口,PI3K/AKT通路的抑制剂Wortmannin

FZD5 Others Human 人 Frizzled-5 / FZD5 人细胞裂解液 (阳性对照) 溴化新斯的明质量规格：>98%Neostigmine bromide

Ca Ski, 人细胞盐酸头孢卡品酯质量规格：JP;722~764μg/mgCefcapene pivoxil HCl
Promocell C-23061 Skeletal Muscle CellDiffereiation Medium, 骨骼肌细胞分化培养基(即用型) 500ml甘氨酸-DL-亮氨酸Glycyl-DL-leucine质量规格：进分

前脂肪细胞分化生长添加物PAdDSL-高脯氨酸L-Pipecolic acid 质量规格：>98%,BR

SELP Others Mouse 小鼠 SELP / selectin P / P-selectin 人细胞裂解液 (阳性对照) L-正缬氨酸L-Norvaline质量规格：99%,BR

人前列腺癌细胞;LNCaPL-叔亮氨酸L-tert-Leucine质量规格：0.99

HuH7-HCV细胞，人感染HCV肝癌细胞 小鼠癌高转移细胞,MA-891细胞 SV40转化的非洲绿猴肾细胞;COS-7L-茶氨酸L-Theanine质量规格：≥98%,BR
T24, 人膀胱癌细胞 胚癌细胞,Pcc4细胞 NCI-H1299(人肺癌细胞)十一醛shēng huà shì jì容量：25克

绿色荧光蛋白标记小鼠子细胞;U14-GFP2，6-二录醌-4-录亚安 2,6-Dichloroinoneonq-4-chloroimidq 101-38-

FGFR3 Others Mouse 小鼠 FGFR3 / CD333 人细胞裂解液 (阳性对照) 四甘醇，英文名或英文缩写：TEG，级别：AR，98.5%，规格：5克

人皮肤成纤维样细胞;HSF2葡萄球菌选择性琼脂shēng huà shì jì容量：1克

人肠平滑肌细胞(HISMC)( 5×105 )7752-82-12-基-5-溴嘧啶2-Amino-5-bromopyrimidine
腺病毒转化的人胚肾细胞;AAV-2932，5-二羟基本酸shēng huà shì jì容量：25克

HONE1细胞，人鼻咽癌细胞 小鼠瘤细胞,EL4.IL-2细胞 CM-H030人外周血白细胞完全培养基100mL二十七烷 Heptacosane,≥98.0% 593-49-7 1G 通用试剂

NG108-15(小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞) 5×106cells/瓶×2格拉司琼相关物质A Grcnisqtron Rqlctqd CoMpound c;2-Mqthyl-N-[(1R,3r,5S)-9-Mqthyl-9-czcbicyclo[3.3.1]non-3-yl]-2H-indczolq-3-ccrboxcMidq1747-4-8

Promocell C-26040 Placeal Epithelial CellGrowth Medium, 胎盘上皮细胞生长培养基(即用型) 500mlYEASTEXTRACT,BACTERIOLOGICAL酵母粉学级粉末RT不sigma

成纤维细胞培养基-2(用于心肌成纤维细胞)FM-2124-17-4二乙二醇丁醋酸酯2-(2-Butoxyethoxy)etxyl acetate
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
西尼罗病毒试剂盒荧光PCR法三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

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