猪圆环病毒II型试剂盒荧光PCR法

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

TNFRSF10D Others Human 人 AILR4 / TNFRSF10D / DCR2 / CD264 人细胞裂解液 (阳性对照) 4-溴甲基-6,7-二甲氧基(>98.0%(HPLC))质量规格：>98.0%(HPLC)4-Bromomethyl-6,7-dimethoxycoumarin

CL-0247ZR-75-1(人癌细胞)5×106cells/瓶×2 DBD-CO-Hz [=4-(N,N-二甲基氨基磺酰)-7-(N-肼基羰甲基-N-甲基)氨基-2,1,3-苯并恶二唑](>98.0%(HPLC))

NRG1 Others Human 人 NRG1-alpha (ECD) 人细胞裂解液 (阳性对照) 质量规格：>98.0%(HPLC)DBD-CO-Hz [=4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-(N-hydrazinocarbonylmethyl-N-methyl)amino-2,1,3-benzoxadiazole]

小鼠甲状腺上皮细胞完全培养基 100mLNBD-CO-Hz [=4-(N-肼羰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑](>95.0%(HPLC))质量规格：>95.0%(HPLC)NBD-CO-Hz [=4-(N-Hydrazinocarbonylmethyl-N-methylamino)-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole]

Sf9昆虫卵巢细胞 Sf9 insect ovarian cells GPM-115无血清无蛋白昆虫细胞悬浮培养基(金普诺安 Cat#GPM001L01)BOC-硝基-L-精氨酸质量规格：>99%,BRBoc-Arg(NO2)-OH
SUNE-1细胞，低分化鼻咽癌细胞系 鼠色素瘤细胞系,B16-Fo细胞 CM-H031人食管上皮细胞完全培养基100mL多菌灵标准溶液(100μg/ml,u=3%)Carbendazim solution质量规格：100μg/ml,u=3%

NR8383(大鼠肺泡巨噬细胞) 5×106cells/瓶×2Cbz-L-苏氨酸苄酯N-Cbz-L-threonine Benzyl Ester质量规格：0.98

Promocell C-26140 Placeal Epithelial CellGrowth Medium KIT, 胎盘上皮细胞生长培养基套装 500ml(+)-2-甲基-L-丝氨酸(+)-2-Methyl-L-serine质量规格：0.99

脑微血管内皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)3,3-二苯基-L-丙氨酸3,3-Diphenyl-L-alanine质量规格：0.98

HA Others H1N1 甲型流感 H1N1 (A/Ohio/07/2009) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人细胞裂解液 (阳性对照) α-甲基-L-苯丙氨酸α-Methyl-L-phenylalanine质量规格：98%,BR,一水物
人食道平滑肌细胞cDNAHESMC cDNA9-去氧-9a-氮杂-同型红霉素A 去甲阿奇霉素质量规格：美国进口9-Deoxo-9a-aza-9a-homo Erythromycin A Desmethyl Azithromycin

COLEC10 Others Cynomolgus 食蟹猴 COLEC10 人细胞裂解液 (阳性对照) 阿奇霉素质量规格：美国进口Azithromycin

小鼠诱导性多潜能干细胞;PUMC-mips-B1阿奇霉素-d3质量规格：美国进口Azithromycin-d3

小鼠诱导性多潜能干细胞;PUMC-mips-B2 胰蛋白酶-EDTA(含100mL酶解缓冲液) 10mLΔ6,7-巴卡丁 III质量规格：美国进口Δ6,7-Baccatin III

MDA-MB-231(ATCC来源), 人癌细胞 Human(R)-奥美拉唑钠盐质量规格：美国进口(R)-Omeprazole  Salt
tTA基因修饰的小鼠胰腺癌细胞(B类);Pan02-CAG-tTA-2D1磺酰酸镍，英文名或英文缩写：Nickel sulfamate，级别：高，98%，规格：1克

ERBB2 Others Mouse 小鼠 ErbB2 / HER2 / CD340 人细胞裂解液 (阳性对照) 2-基-5-肖基本加醋 2-Mqthyl-5-nitnobqnzoic ccid1972/2/6

猪圆环病毒II型试剂盒荧光PCR法LCC1 人癌细胞艾狄密新，英文名或英文缩写：Erythromycin，级别：BR，10u/mg，规格：5克

HCC1937人癌细胞 Human breast cancer cell line HCC1937 RPMI-1640(GIBCO)+10%FBS十二酸钠，英文名或英文缩写：wo7ium dodecanoate，级别：超，99%，规格：1克

EPO Protein Mouse 重组小鼠 Erythropoietin / EPO 蛋白 (His 标签)27565-41-9二硫代苏糖醇1 4-DITHIO-DL-THREITOL(+4℃)

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