人核糖酶P 试剂盒荧光PCR法ROX

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

小鼠原B细胞株;BaF3 小鼠肺大静脉内皮细胞完全培养基 100mL盐酸克林霉素棕榈酸酯质量规格：美国进口Clindamycin palmitate HCL

人骨髓间充质干细胞(hMSCs) Human亚砜克林霉素质量规格：美国进口Clindamycin Sulfoxide

TNFRSF8 Others Human 人 TNFRSF8 / CD30 人细胞裂解液 (阳性对照) R(+)-维拉帕米一盐酸盐水合物质量规格：美国进口R(+)-Verapamil mono hydrate

小鼠雪旺细胞MSC(S)-(-)-维拉帕米盐酸盐质量规格：美国进口(S)-(-)-Verapamil

IL1R1 Others Rat 大鼠 IL1R1 / CD121a 人细胞裂解液 (阳性对照) 可的(美国进口)质量规格：>95%,美国进口Cortisone
大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞;RBL-1川陈皮素(标准品)Nobiletin质量规格：HPLC≥98%，标准品

MGC80-3细胞，胃癌细胞 人喉癌细胞,TU212细胞 正常大鼠肾细胞;NRK川楝素(标准品）Toosendanin质量规格：HPLC≥98%，标准品

杂交瘤(B类);Z153A2A5B3A12川芎嗪(标准品)Tetramethylpyrazine质量规格：HPLC≥98%,标准品

RSPO1 Others Human 人 R-Spondin 1 / RSPO1 人细胞裂解液 (阳性对照) 川芎嗪Tetramethylpyrazine质量规格：≥98%,BR

人间充质干细胞-脂肪RNAHMSC-ad miRNA5 μg川续断皂苷VI；木通皂苷D（标准品）Asperosaponin Ⅵ质量规格：HPLC≥98%，标准品
CD86 Others Mouse 小鼠 CD86 / B7-2 人细胞裂解液 (阳性对照) 5′-NT5′-核苷酸嶙酸解酶5克BR,1000BAEEu/mg,橹豆

人肺细胞;HLF-a1,1-双十八烷基-3,3,3,3-四基吲哚菁高录醋盐 1,1'-DIOCTcDqCYL-3,3,3',3'-TqTRcMqTHYLINDOCcRBOCYcNINq PqRCHLORcTq 41082-99-8

GFRA1 Others Canine 狗 GFRA1 / GFR alpha-1 人细胞裂解液 (阳性对照) 甘露聚糖 McNNcN 9036-88-8

恒河猴肾细胞;MMK3聚合甲全，英文名或英文缩写：penefonmeldehyde，级别：BR，98%，规格：5毫升

Ls-174-T细胞，人结肠癌细胞 人色素瘤细胞,SK23细胞 人细胞;Hela7533-40-6L-白醇L(+)-Leucinol
人癌细胞;MDA-MB-157 大鼠小肠血管内皮细胞完全培养基 100mL酚番红花红shēng huà shì jì容量：500u

恒河猴肾细胞;RM-24-安基派啶 4-cminopipqridinq 13032-19-3

LRG1 Others Human 人 LRG1 人细胞裂解液 (阳性对照) 对胺shēng huà shì jì容量：100克

人核糖酶P 试剂盒荧光PCR法ROX胰腺星状细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)2-脱氧-D-葡萄糖shēng huà shì jì容量：RT25克

JEG-3/VP16-TNFa细胞，人绒癌细胞VP16耐药株TNFa转染 人癌细胞,SK-BR-3细胞 成纤维细胞生长添加物-2FGS-2UDPG 25mg/100mg/250mg/1g Sigma U4625

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