牛种特异性基因试剂盒荧光PCR法

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

犬前列腺特异性抗原(PSA)试剂盒 Canine prostate specific aigen,PSA ELISA Kit 3',3'',5',5''-四酚酞乙酯(80%,用于显微镜)  3',3'',5',5''-Tetrabromophenolphthaleinethyl ester  质量规格：80%,用于显微镜

犬热休克蛋白60,线粒体(HSPD1/Hsp-60)试剂盒 Dog 60 kDa heat shock protein,mitochondrial,HSPD1 ELISA kit 二甲基亚砜(AR,>99%(GC))   Dimethyl sulfoxide  质量规格：AR,>99%(GC)

犬热休克蛋白70(HSP-70)试剂盒 Canine Heat Shock Protein 70,HSP-70 ELISA Kit 二甲基亚砜(>99.8%(GC))   Dimethyl sulfoxide  质量规格：>99.8%(GC)

犬热休克蛋白70kDa蛋白1A(HSPA1A)试剂盒 Dog heat shock 70 kDa protein 1A,HSPA1A ELISA kit 二甲基亚砜(分子生物学,≥99.9%)   Dimethyl sulfoxide  质量规格：分子生物学,≥99.9%

犬软骨寡聚基质蛋白(COMP)试剂盒 Dog cailage oligomeric maix protein,COMP ELISA kit 二甲基亚砜(多肽合成)   Dimethyl sulfoxide  质量规格：多肽合成

犬状腺原氨酸(T3)ELISA检测试剂盒Caninei-iodothyronine,T3 96T/48T 二甲基亚砜(药用级)   Dimethyl sulfoxide  质量规格：药用级

犬状腺原氨酸(T3)试剂盒 Canine i-iodothyronine,T3 ELISA Kit 2,2′-双双苯(98.0%)  2,2′-Dibromobiphenyl  质量规格：0.98

犬神经型合成酶(nNOS)试剂盒 Canine Neuronal Niic Oxide Syhase,nNOS ELISA Kit 2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸盐(≥98.0%)  2,4,5,6-Tetraaminopyrimidine sulfate salt  质量规格：≥98.0%

犬肾上腺髓质素(ADM)ELISA检测试剂盒Canineadrenomedullin,ADM 96T/48T 烟酸甲酯(99%)  Methyl nicotinate  质量规格：0.99

犬肾上腺髓质素(ADM)试剂盒 Dog adrenomedullin,ADM ELISA Kit N-甲基-N-(基硅基)乙酰胺(97%)  N-Methyl-N-(trimethylsilyl)acetamide  质量规格：0.97
二甲基亚砜(AR,>99%(GC))   Dimethyl sulfoxide  质量规格：AR,>99%(GC) 犬热休克蛋白60,线粒体(HSPD1/Hsp-60)试剂盒 Dog 60 kDa heat shock protein,mitochondrial,HSPD1 ELISA kit

二甲基亚砜(>99.8%(GC))   Dimethyl sulfoxide  质量规格：>99.8%(GC) 犬热休克蛋白70(HSP-70)试剂盒 Canine Heat Shock Protein 70,HSP-70 ELISA Kit

二甲基亚砜(分子生物学,≥99.9%)   Dimethyl sulfoxide  质量规格：分子生物学,≥99.9% 犬热休克蛋白70kDa蛋白1A(HSPA1A)试剂盒 Dog heat shock 70 kDa protein 1A,HSPA1A ELISA kit

二甲基亚砜(多肽合成)   Dimethyl sulfoxide  质量规格：多肽合成 犬软骨寡聚基质蛋白(COMP)试剂盒 Dog cailage oligomeric maix protein,COMP ELISA kit

二甲基亚砜(药用级)   Dimethyl sulfoxide  质量规格：药用级 犬状腺原氨酸(T3)ELISA检测试剂盒Caninei-iodothyronine,T3ELISAKit 96T/48T

2,2′-双双苯(98.0%)  2,2′-Dibromobiphenyl  质量规格：0.98 犬状腺原氨酸(T3)试剂盒 Canine i-iodothyronine,T3 ELISA Kit

2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸盐(≥98.0%)  2,4,5,6-Tetraaminopyrimidine sulfate salt  质量规格：≥98.0% 犬神经型合成酶(nNOS)试剂盒 Canine Neuronal Niic Oxide Syhase,nNOS ELISA Kit

烟酸甲酯(99%)  Methyl nicotinate  质量规格：0.99 犬肾上腺髓质素(ADM)ELISA检测试剂盒Canineadrenomedullin,ADMELISAKit 96T/48T

N-甲基-N-(基硅基)乙酰胺(97%)  N-Methyl-N-(trimethylsilyl)acetamide  质量规格：0.97 犬肾上腺髓质素(ADM)试剂盒 Dog adrenomedullin,ADM ELISA Kit

苔黑酚一水合物(98%)  Orcinol monohydrate  质量规格：0.98 犬肾素(Renin)ELISA检测试剂盒CanineReninELISAKit 96T/48T
小鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)ELISA 试剂盒 96T/48T 试剂盒 组装/原装 锌试剂  Zincon  质量规格：AR

Rat soluble Toll like receptor 2 (sTLR2) ELISA Kit 大鼠可溶性Toll样受体2(sTLR2)ELISA试剂盒 铅试剂  Dithizone  质量规格：AR

Humanplasmin/fibrinolysin,PL/FbnELISAKit 人纤溶酶/纤维蛋白溶酶(PL/Fbn)ELISA试剂盒 96T/48T 进口分装 镁试剂I  MagnesonI  质量规格：AR

Humanai-epidemichemorrhagicfevervirusIgMaibody,EHFIgMELISA试剂盒人抗流行性出血热病毒抗体IgM(EHF)ELISA试剂盒规格：96T/48T 镁试剂II  MagnesonII  质量规格：AR

人抗白色(C.albicans)IgE抗体 试剂盒 Human Candida Albicans(C.albicans)IgE aibody ELISA Kit 二氢辣椒素酯 HPLC≥98% 10mg

人抗斑疹伤寒抗体(ai-typhus-Ab)试剂盒 Human ai-typhus aibody ELISA Kit 二氢辣椒碱（标准品）  Dihydrocapsaicin  质量规格：HPLC≥98%，标准品

人抗表皮细胞基底膜抗体(EBMZ)试剂盒 Human epidermal baseme membrane zone,EBMZ ELISA Kit 二氢辣椒碱 HPLC≥98% 20mg

人抗补体1q抗体(ai-C1q-aibody)试剂盒 Human ai-C1q-aibody ELISA Kit 二氢柯楠因 HPLC≥95% 20mg

人抗促甲状腺素受体抗体(Ab)试剂盒 human thyroid stimulating hormone receptor aidoby,Ab ELISA Kit 二氢姜黄素 HPLC≥98% 20mg

人抗促卵泡素抗体(Ai FSH Ab)试剂盒 Human Ai FSH Ab ELISA Kit 二氢黄连碱 HPLC≥98% 20mg

人抗单核细胞抗体(AMA)试剂盒 Human ai-Monocyte aibody,AMA ELISA Kit 二氢葫芦素B HPLC≥95% 20mg
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
牛种特异性基因试剂盒荧光PCR法三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤���过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。