恶性疟原虫（PF）试剂盒荧光-PCR法

PCR实验方法��骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

绵羊皮肤细胞;OAR-S1 小鼠原成骨细胞，MC3T3-E1 Subclone 14细胞 TM3细胞，正常小鼠Leydig细胞L-苯丙氨醇 质量规格：>98%,BRL-Phenylalaninol

人皮肤成纤维细胞;HSAS4L-色氨醇 质量规格：0.97L-Tryptophanol

HA Others H11N9 甲型流感 H11N9 (A/mallard/Alberta/294/1977) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人细胞裂解液 (阳性对照) Fmoc-缬氨醇 质量规格：>98.5%,BRFmoc-Valinol

CL-0354HFSF(人胚胎眼巩膜成纤维细胞)5×106cells/瓶×2L-赖氨酸质量规格：HPLC≥98%，标准品L-Lysine

NOV Others Human 人 CCN3 / NOV 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) L-赖氨酸质量规格：>98%,BRL-Lysine
人T细胞白血病细胞;HuT 78洛沙坦Losartan Carboxaldehyde质量规格：美国进口

人卵巢成纤维细胞(HOF) ( 5×105 )N,O-双(叔丁基二甲硅基)乙酰胺(>95.0%(GC))N,O-Bis(tert-butyldimethylsilyl)acetamide 质量规格：>95.0%(GC)

CM-R048大鼠肠巨噬细胞完全培养基100mL1-(二甲基异丙基硅基)咪唑(>98.0%(T))1-(Dimethylisopropylsilyl)imidazole质量规格：>98.0%(T)

小鼠色素瘤细胞;B16 小鼠肝实质细胞完全培养基 100mL1,3-双(氯甲基)四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))1,3-Bis(chloromethyl)tetramethyldisilazane质量规格：>95.0%(GC)

MA, 小鼠星形胶质细胞 Mouse1,3-二苯基四甲基二硅氮烷(>95.0%(GC))Tetramethyl-1,3-diphenyldisilazane质量规格：>95.0%(GC)
EFNB2 Protein Canine 重组狗 Ephrin-B2 / EFNB2 蛋白 (Fc 标签)2-氨基-4'-氯二苯甲酮质量规格：大于98%，化学2-amino-4'-chlorobenzophenone

U-87 MG(人神经胶质瘤细胞) 5×106cells/瓶×2 小鼠树突状细胞肉瘤细胞;DCS原百部碱(标准品)质量规格：HPLC≥98%，标准品Protostemonine

人小气道上皮细胞裂解物HSAEpiCL雪上一枝蒿甲素质量规格：标准品,用于含量测定Bullatine A

CTF1 Others Human 人 Cardioophin-1 / CTF1 人细胞裂解液 (阳性对照) 麦冬皂苷D' 质量规格：HPLC≥98%，标准品ophiopogonin D'

小鼠血细胞;WEHI-3 [WEHI3]2'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)紫杉醇质量规格：美国进口2'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)paclitaxel
REG3D Others Mouse 小鼠 REG3D 人细胞裂解液 (阳性对照) NEXTGEL10%SOLUTIONNext Gel 10%蛋白组学级透明无色液体RTsigma

狗肺成纤维样细胞;DogL13,4-二 3,4-Dimethoxybenzyl alcohol,96% 1993-3-8 5G 通用试剂

GLIPR1 Others Mouse 小鼠 GLIPR1 / RTVP1 人细胞裂解液 (阳性对照) 糠安;2-呋安;麸安 FurfurylcMinq;2-Furc恶性疟原虫（PF）试剂盒荧光-PCR法nMqthylcMinq;2-FurylMqthylcMinq

破骨细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)N-Fmoc-N'-三本甲基-D-半胱酸，英文名或英文缩写：Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，级别：特，98%，规格：25克

Cyc-tAg细胞，小鼠T细胞瘤(SV40T抗原转染) 人卵巢癌紫杉醇耐药株,A2780/Taxol细胞 人肺动脉成纤维细胞裂解物HPAFL高录酸铵(*)(易)AMMONIUM PERCHLORATE

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