乙型肝炎病毒ccc DNA(HBV-cccDNA)试剂盒荧光PCR法

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

人星形胶质细胞 (HA) (1×106 ) 小鼠皮层神经胶质细胞(EGFP标记) Mouse钒标准溶液(100mg/L,基体:1%HCI)质量规格：100mg/L,基体:1%HCIVanadium standard

CM-H073人膀胱成纤维细胞完全培养基100mL镱标准溶液(1000μg/ml)质量规格：1000μg/mlYtterbium standard

TNFRSF10D Others Cynomolgus 食蟹猴 AIL R4 / CD264 / TNFRSF10D 人细胞裂解液 (阳性对照) 地西他滨/ 5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷质量规格：>99.5%,BR,可用于细胞培养Decitabine

人成纤维母细胞-新生HDF-n地西他滨/ 5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷（标准品）质量规格：HPLC>98%,标准品Decitabine

RWPE-1细胞，人正常前列腺上皮细胞 小鼠B细胞杂交瘤细胞,SH3细胞 成纤维细胞培养基-2(用于心肌成纤维细胞)FM-25-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷质量规格：>97%,进分sigma货号A3656 5-Aza-2′-deoxycytidine
人肺癌细胞;A549 [A-549] 人脑成纤维细胞完全培养基 100mL5-O-去甲基奥美拉唑硫化物5-O-Desmethyl Omeprazole Sulfide质量规格：美国进口

人肝窦内皮细胞cDNAHHSEC cDNA奥美拉唑 Omeprazole质量规格：>99%,USP33,BR,可用于细胞培养

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF-mt)(5×105)奥美拉唑 （标准品）Omeprazole质量规格：HPLC>98%,标准品

大鼠肝细胞;IAR20氯唑沙宗Chlorzoxazone质量规格：>98.5%,BR

小鼠诱导性多潜能干细胞;PUMC-mips-A2 小鼠肝外胆管上皮细胞完全培养基 100mL氯唑沙宗（标准品）Chlorzoxazone质量规格：HPLC>98%,标准品
人内膜腺癌细胞;HEC-1-B磺胺二甲氧嗪; 磺胺二甲氧基嘧啶质量规格：>99%,ARSulfadimethoxine

人成纤维母细胞-(HDF-a)( 5×105 )磺胺二甲氧基嘧啶(标准品)质量规格：HPLC>98%,标准品Sulfadimethoxine

人星形胶质细胞奥斯他伟酸;奥司他韦羧酸质量规格：>97,BROseltamivir acid

人结直肠腺癌细胞;LoVo 大鼠输尿管上皮细胞完全培养基 100mLalpha-熊果苷(标准品)质量规格：HPLC≥98%,标准品alpha-Arbutin

PC-12(高分化) 大鼠肾上腺嗜鉻细胞瘤细胞(高分化)L-甲状腺素钠盐五水化合物质量规格：>98%,BRL-Thyroxine  Salt Pentahydrate
SLAMF6 Others Human 人 SLAMF6 / Ly108 人细胞裂解液 (阳性对照) D-乳酸脱氢酶1克保存：-20℃，避光

CL-0005293T(人胚肾细胞)5×106cells/瓶×22,6-二本安;2-安基间二本;1-安基-2,6-二本;2-安基-1,3-二基本;连间二本安 2,6-DiMqthylcnilinq;2-cMino-1,3-diMqthylbqnzqnq;vic-M-Xylidinq;2,6-Xylidinq;2-cMino-M-xylqnq;1-cMino-2,6-diMqthylbqnzqnq1987/6/7

乙型肝炎病毒ccc DNA(HBV-cccDNA)试剂盒荧光-PCR法KB/V细胞，人口腔上皮癌长春新碱耐药株 人血管内皮细胞,EC-304细胞 大鼠骨髓瘤细胞;Y3-Ag1.2.3磺胺二5克2～8℃

BxPC-3(人原位胰腺腺癌细胞) 5×106cells/瓶×2嶙酸三钠100克

CN3 Others Human 人 CN3 / Coactin-3 人细胞裂解液 (阳性对照) 1921-70-6姥鲛烷PRISTANE