亨德拉病毒(EMV)试剂盒荧光-PCR法

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

小鼠少突胶质前体细胞(MOPC)(5×105) Hep-2, 人喉癌细胞系 Human葫芦素E（标准品）质量规格：HPLC≥95%，标准品Cucurbitacin E

中国仓鼠卵巢细胞(亚系克隆);CHO-HCV-NS3钩吻素子（标准品）质量规格：HPLC≥98%，标准品Koumine

人肝内胆管上皮细胞 (HIBEC)( 5×105 )钩吻素甲（标准品）质量规格：HPLC≥98%，标准品Gelsemine

CL-0059CFPAC-1(人胰腺癌细胞)5×106cells/瓶×2原B1（标准品）质量规格：HPLC≥95%，标准品Procyanidin B1

小鼠畸胎瘤细胞;P19 小鼠肺微血管内皮细胞完全培养基 100mL天麻素质量规格：HPLC≥98%，BRGastrodin
人脊髓星形胶质细胞裂解物HA-sp L草酸盐苄基肼Benzylhydrazine oxalate salt质量规格：美国进口

CD55 Others Rat 大鼠 CD55 / DAF 人细胞裂解液 (阳性对照) N-去甲酰-N-苄氧羰基奥利司他N-Deformyl-N-benzyloxycarbonyl Orlistat质量规格：美国进口

人小脑颗粒细胞完全培养基 100mL(2S,3R,5S)-5-[(N-甲酰-L-亮氨酰)氧]-2-己基-3-羟基十六烷酸(奥利司他杂质)(2S,3R,5S)-5-[(N-Formyl-L-leucyl)oxy]-2-hexyl-3-hydroxyhexadecanoic Acid (Orlistat Impurity)质量规格：美国进口

NRK细胞，大鼠肾小管上皮细胞 PT-67(病毒转染小鼠细胞) 猪肾细胞;PK(15)C17鞘氨醇C17 Sphingosine质量规格：美国进口

EFNA3 Protein Human 重组人 Ephrin-A3 / EFNA3 蛋白 (His 标签)D-赤-鞘氨醇 C-15D-erythro-Sphingosine C-15质量规格：美国进口
CD47 Others Rat 大鼠 CD47 人细胞裂解液 (阳性对照) 十五烷酸1克

人角膜上皮细胞完全培养基 100mL肌激酶 Myokinase from chicken muscle 9013-2-9 1KU 通用试剂

HPT-8细胞，小鼠饲养层上皮细胞 293(转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞) 长白山猪胚胎皮肤成纤维样细胞;201184衣康腊酐 Itcconic cnhydridq170-3-8

EFNB2 Protein Human 重组人 Ephrin-B2 / EFNB2 蛋白 (His & Fc 标签)无水氧化钡，英文名或英文缩写：Barium oxide，级别：CP，99%，规格：25克

EA.hy926(人脐静脉细胞融合细胞) 5×106cells/瓶×2 大隐静脉平滑肌细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)Paclobutrazol 10g/250g 国产
751-03-1黄柏酮厂家  Obacunone   组织1酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase;GPI)活性光谱法定量检测试剂盒20

74805-92-8麦冬甲基黄烷酮A厂家  Methylophiopogonanone A   组织1酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomase;PGM)活性光谱法定量检测试剂盒20

74805-92-8甲基麦冬二氢高异黄酮A品牌  Methylophiopogonanone A   组织1酸甲戊二羟酸激酶(phosphomevalonatekinase)活性比色法定量检测试剂盒20

74805-91-7甲基麦冬二氢高异黄酮B规格  Methylophiopogonanone B   组织1酸果糖激酶(PHOSPHOFRUCTOKINASE)酶连续循环比色法定量检测试剂盒20

74805-90-6甲基麦冬黄酮A品牌  Methylophiopogonone A   组织1酸二酯酶5(PDE5)活性荧光定量检测试剂盒10
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
亨德拉病毒(EMV)试剂盒荧光-PCR法６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。