猪肺炎支原体（MHP）定性试剂盒PCR法

PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

产品特点: 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强

储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内**的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

TIMP2 Others Human 人 TIMP2 / TIMP-2 人细胞裂解液 (阳性对照) 2‘-脱氧胞苷质量规格：>98%,BR2'-Deoxycytidine;2'-dC

CL-0167NCI-H292(人肺癌细胞)5×106cells/瓶×22‘-脱氧胞苷(标准品)质量规格：HPLC>98%,标准品2'-Deoxycytidine;2'-dC

CD8B Others Human 人 CD8B / P37 / LEU2 人细胞裂解液 (阳性对照) 2’-脱氧腺苷质量规格：>99%,BR2'-Deoxyadenosine monohydrate

小鼠肠静脉内皮细胞完全培养基 100mL鱼精DNA质量规格：进分，Sigma74782,蛋白小于1%DNA, Fishsperm

marc-145猴胚胎肾上皮细胞 Marc-145 monkey embryonic kidney epithelial cells DMEM+10% FBS2,5-二苯基恶唑(>98%,BC)质量规格：>98%,BCPPO
小鼠细胞白血病;L1210Nα-BOC-D-精氨酸盐酸盐一水合物Nalpha-BOC-D-Arginine  hydrate质量规格：BR

HELF细胞，人胚肺成纤维细胞 鼠胚成骨细胞,3T3-E1细胞 CL-0146LTEP-a-2(人肺腺癌细胞)5×106cells/瓶×2Boc-Arg(Mts)-OH·CHABoc-Arg(Mts)-OH·CHA质量规格：BR

TM3(小鼠间质细胞) 5×106cells/瓶×2BOC-L-缬氨酸Boc-Val-OH质量规格：>99%,BR

HPF-c 人类肺成纤维细胞(HPF) 500,000cells 腮腺细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)BOC-L-天冬酰胺Boc-Asn-OH质量规格：≥98.5%,BR

脑膜细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)Boc-L-谷氨酰胺Boc-Gln-OH质量规格：>98.5%,BR
人神经母细胞瘤细胞;SH-SY5Y1,4-二羟基醌shēng huà shì jì容量：RT25克

21. 脐带细胞系统四正丁基化铵 Tetrabutylammonium chloride.≥97.0 1112-67-0 5G 通用试剂

CM-H104成纤维细胞完全培养基100mLα-异十三烷基-ω-羌基-聚(氧-1,2-亚基) GqNcPOL(R) X-080 9043-30-2

小鼠胚胎成纤维细胞;PA317 小鼠小肠平滑肌细胞完全培养基 100mLN-Hexadecane正十六烷**无色液体RTsigma

RN-c, 大鼠皮质神经元 Rattus67-43-6二异胺DiisopropylaMine;N-(1-metxyletxyl)-2-propanaMine; DIPA;
IL1RN Others Human 人 IL1RA / IL1F3 人细胞裂解液 (阳性对照) 洋橄榄油，英文名或英文缩写：Olive oil，级别：BR，97%，规格：5克

非洲绿猴肾细胞;VERO6-鳞醋-葡萄糖醋-三内盐(-20℃) 6-PHOSPHOGLUCONIC cCID TRIwo7ium ScLT 23411-70-4

ITK Others Mouse 小鼠 ITK Kinase (aa 351-619) 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) N-乙酰本，英文名或英文缩写：Acetanilide，级别：CP，规格：5克

CL-0193RD(人恶性胚胎横纹肌瘤细胞)5×106cells/瓶×2十二烷shēng huà shì jì容量：1克

MDA-MB-231(ATCC来源), 人癌细胞 人胚肾T细胞，293T细胞 P19(畸胎癌细胞)Poly-L-Lysine 25mg/100mg/1g原装 Sigma P2636
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
猪肺炎支原体（MHP）定性试剂盒PCR法三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤高压。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。