细胞培养

细胞培养操作规程：

主要功能：

（1）血管平滑肌细胞的再生能力是原发血管病变的重要因素。

（2）表达钙通道及ICAM-1和VCAM-1，参与血管壁的炎症反应。

（3）与血管的进展和稳定有关。

 生理变化：

（1）主动脉硬化。

（2）主动脉瘤

（3）主动脉钙化。

基本特性：

（1）组织来源于正常大鼠大动脉组织。

（2）鉴定：肌动蛋白，alpha-SMA和Desmin荧光染色。

（3）原代细胞培养末期液氮冻存。

（4）每冻存管细胞数：>5×105 cells/1ml。

（5）肌动蛋白，alpha-SMA和Desmin荧光染色验证。

（6）不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原体、酵母。

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培养步骤：

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞|细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；胎牛血清，10%。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

操作要点：

1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过*易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6）观察细胞贴壁生长情况，换���鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

大鼠白介素"1000U T4 核酸内切酶 V T4 Endonuclease V -20℃保存
500U 烷基腺嘌呤DNA糖基化酶 AAG（Alkyladenine DNA Glycosylase） -20℃保存
500U 甲酰胺嘧啶 [fapy]-DNA 糖基化酶 FPG（Formamidopyrimidine DNA Glycosylase） -20℃保存
500U 尿嘧啶-DNA糖基化酶 Uracil DNA Glycosylase（UDG） -20℃保存
80U 8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶 OGG1（8-Oxoguanine DNA Glycosylase） -20℃保存
200U 尿嘧啶糖基化酶抑制剂 Uracil Glycosylase Inhibitor (UGI) -20℃保存
200U Afu 尿嘧啶 - DNA 糖基化酶 Afu Uracil-DNA Glycosylase -20℃保存
50U 尿嘧啶切刻酶 Uracile Nicking Enzyme -20℃保存
500U 人类单链选择性单功能尿嘧啶-DNA糖基化酶 hSMUG1 -20℃保存
500U Dam 甲基转移酶 Dam Methyltransferase -20℃保存
100U CpG 甲基转移酶（M.SssI） CpG Methyltransferase（M.SssI） -20℃保存
200U GpC 甲基转移酶 (M.CviPI) ＧpＣ Methyltranferase (M.CviPI) -20℃保存
200U T4聚核苷酸激酶 T4 Polynucleotide Kinase -20℃保存
细胞培养人 DCXR 基因全长ORF克隆
人 CRIPT 基因全长ORF克隆
人 LSM3 基因全长ORF克隆
人 BPI 基因全长ORF克隆
人 LGMN 基因全长ORF克隆
人 IL7 基因全长ORF克隆
人 F13A1 基因全长ORF克隆
人 AFM 基因全长ORF克隆
人 LIF 基因全长ORF克隆
人 KRT16 基因全长ORF克隆
人 CD207 基因全长ORF克隆"