土壤生物和生物化学性质分析
8.1采样与样品预处理
土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物（如蚯蚓）等，然后迅速过筛（2～3mm），或放在低温下（2～4ºC）保存，如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到40％左右的田间持水量，在室温下放在密闭的装置中预培养1周，密闭容器中要放人两个适中的烧杯，分别加入水和稀NaOH浴液，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤*好立即分析，也可放在低温下（2～4ºC）保存。
8.2土壤微生物生物量的测定
土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10µm3活的微生物总量，是土壤有机质中*活跃的和*易变化的部分。耕地表层土壤中，微生物生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右。土壤微生物生物量与土壤中的C、N、P、S等养分的循环密切相关，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和土壤肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺昔（ATP）法。每种方法都有其优点、缺点和适用范围及条件，一般根据实验室的仪器设备和条件，以及研究的目的，选择测定土壤微生物生物量的方法。
氯仿熏蒸培养法（FI）
方法原理该方法是基于以下5个假设：①被杀死的微生物生物量中的碳较活体中的碳能更快地被分解；②熏蒸**处理很完全；③没有熏蒸**的土壤，在培养期间微生物死亡极少，可以忽略不计；④被熏蒸杀死的微生物，在培养期间被分解的比例，所有土壤都一样，即所有的土壤可以用一个共同的转换系数Kc值；⑤熏蒸**处理对土壤物理和化学性质没有任何影响。
实际上，完全符合这5个假设是不可能的。目前所用的方法是基于土壤经氯仿熏蒸处理后，再进行培养时，有大量的CO2释放出来。所释放CO2是来源于被氯仿熏蒸杀死的微生物。以不熏蒸土壤在培养期间所释放的CO2量做为空白，根据二者之间的差值来计算土壤微生物生物量碳。该方法*大的困难是空白的选择，目前还没有统一的看法。该方法不适用于pH＜4.5的酸性土壤，也不能用于含有大量易分解有机物的土壤，用于渍水土壤和石灰性土壤时也要慎重。
结果计算
1. CO2-C的释放量（Fc）mg kg-1=（V1-V2）*C*M*1000*k/m
式中：
V1：土样处理滴定时所消耗的盐酸体积，mL；V2：无土空白对照滴定时所消耗的盐酸体积，mL；C：盐酸标准溶液的浓度，molL-1；M：碳的毫摩尔质量，12mgmmo1-1；1000：转换为kg的系数；k：分取偌数；m：土壤样品的烘于质量，g。
2. 微生物生物量碳（Bc）mg kg-1 = Fc/Kc
式中：
Fc：0～10天培养期间熏蒸土壤释放的CO2-C量与未熏蒸土样培养期间释放的CO2-C量的差值，mgkg-1，Kc：培养期间被杀死的微生物矿化成CO2-C的比例，常取0.45。
3. 微生物生物量氮（BN）mg kg-1 =FN/KN
式中：
FN：[（熏蒸土样中NO3--N +NH4+-N）] -[（未熏蒸土样中NO3--N +NH4+-N）]，mgkg-1；KN为培养期间被杀死的微生物量中的氮转化为NO3--N和 NH4+-N的比例，一般为0.57。
8.3土壤呼吸作用的测定
土壤呼吸作用一词有各种不同的含义，但一般系指土壤中活的，有代谢作用的实体，在代谢过程中吸收氧和释放CO2的强度。
土壤呼吸来源于生物和非生物两个方面。生物来源包括土壤微生物的呼吸，植物根系的呼吸和原生动物的呼吸。非生物来源主要是化学的氧化过程。在这些来源中，土壤微生物的呼吸是主要的。它通过呼吸（O2的吸收和CO2的释放）来表现它的代谢过程，反映生态系统中能流、物流的动态过程及方向。土壤中的**、**、藻类和原生动物的细胞，对O2的吸收或CO2的释放，也包括由好气和嫌气代谢所产生的气体交换，因此，又称为微生物呼吸作用。
土壤呼吸作用强度能反映土壤中有机质的分解，以及土壤有效养分的状况，因此，很早以来就被人们利用它作为土壤微生物总的活性指标或作为评价土壤肥力的尺度之一。无疑，测定土壤呼吸作用对研究土壤中的生物化学反应和土壤有机质的分解速率均有重要意义。
测定土壤呼吸作用的方法很多，都是以测定其过程中O2的吸收值和CO2释放量为内容，据此，研究者们设计了各种测定装置，既有简单可行的野外测定方法，也有灵敏可靠的仪器分析方法，如滴定法、容量法、比色法、重量法、比浊法、电导法、仪器分析法、红外吸收光谱、气相色谱、质谱分析、测压法和气体分析法等，这些方法各有特点，但尚无标准方法。大多测定土壤中CO2的释放量。
室内密闭培养法
方法原理利用一定浓度的NaOH溶液吸收土壤呼吸所释放出的CO2，然后用标准HCl溶液滴定剩余的NaOH量，根据NaOH溶液的消耗量，计算出CO2的释放量。
结果计算
CO2（mg kg-1）={[(V0-V)*C*0.022*（22.4/44）*1000]*2*1000}/m
式中：
V0：空白滴定时消耗标准盐酸的体积，mL；V：样品滴定时消耗标准盐酸的体积，mL；C：标准盐酸的浓度，molL-1；0.022：CO2的毫摩尔质量，gmmol-1；22.4*1000/44：标准状态下每克CO2的毫升数。
注意事项
1. 培养前，试验用的培养瓶要经过认真挑选，确保培养瓶与内外盖紧密配套。
2.粘粒含量高的土壤（如第四纪红粘土），培养时调节水分一般不要超过该土壤*大持水量的40％。水分太高，CO2释放受阻，从而导致土壤呼吸强度减弱。
3.为确保培养过程中培养瓶不漏气，*好在盖内盖之前，先加蒙一层塑料胶带，以防CO2损失，结果偏低。
8.4土壤酶活性的测定
土壤中养分的循环过程涉及到各种生物化学、化学和物理化学反应。其中，生物化学过程是由酶的催化作用完成的。这种由酶参与的生物化学反应可以发生在植物根系和土壤生物的细胞内（包括细胞膜和细胞壁上），是生命代谢活动的一部分。而发生在细胞外土壤介质中的生物化学反应，则是由土壤酶来完成的，土壤酶来源于植物、动物和微生物，在土壤中主要参与各种有机物质的分解、合成与转化，以及无机物质的氧化与还原等过程。土壤酶以游离形态存在的数量很少，绝大多数土壤酶与土壤有机和无机固相物质相结合，形成酶-有机-无机复合体。
土壤酶活性是土壤肥力的一个重要指标，它在很大程度土反映了土壤中物质循环与转化的强度。土壤酶活性一般用单位重量的土壤在单位时间内反应物的生成量或底物的减少量来表征。然而，由于测定条件和方法的限制，对测定结果进行解释时应小心。这主要是因为实验室的测定是在*适培养条件下进行的，难以反映出土壤酶在田间实际条件下的活性。此外，现行的抑制生物活性的方法难以做到既能有效地抑制土壤生物的话性，又能防止胞内酶的释放，因此，测定的土壤酶活性可能包括了来自土壤生物作用部分的结果。
方法原理土壤酶催化的土壤生物化学反应与生物体内的酶促反应一样，具有专一性以及对底物较强的亲合能力。在进行催化反应时，土壤酶首先与底物形成复合体，这种复合体是不稳定的，经过一步或者数步的重新组合，释放出酶和产物。某一特定土壤酶的活性可通过测定由该酶催化的化学反应速率来表征，测定的结果以单位重量的土壤在单位时间内产物的生成量或者底物的减少量来表示。
影响酶舌性的因素
1. 酶和底物的浓度土壤酶的活性取决于酶和底物的浓度。对给定的时间和样品，土壤酶的浓度可以认为是一个常数。此时，大多数土壤酶催化的生物化学反应符合零级或**化学动力学反应，与底物的浓度有关。这些反应可用酶动力学方程式（米氏方程式）来描述。
2. 温度 任何化学反应的反应速率均随着温度的升高而增加，大约每升高10℃，反应速率增加1倍。酶在高温下容易失活，因此当温度升高到一定时，反应速率下降。大多数土壤酶在60～70℃变性，有些土壤酶发生变性的温度较低。土壤酶的稳定性随着温度的降低而增加。
3．pH氢离子浓度影响土壤酶、底物等的离子化程度和溶解度，从而影响酶结构的稳定性和与底物的亲合能力。任何酶都在一个特定pH（*适pH）时活性*大，高于或低于该值，酶的活性均下降。因此测定土壤酶活性常常是在缓冲溶液中进行。
4. 其他因素许多酶只有在与非蛋白质物质结合时才表现出活性，这些非蛋白质因子包括辅基、辅酶。此外，有些酶还需要金属离子来激活。许多种化学物质能够抑制土壤酶的活性。酶抑制剂的种类很多，有些抑制剂与酶的作用部位结合，有的与酶激活剂和辅酶结合，抑制酶的活性。其抑制作用有可逆的，也有导致酶完全失活的不可逆反应。在可逆性抑制作用中，有竞争性抑制，也有非竞争性抑制。而且，产物对酶促反应也会产生反馈抑制作用。
8.4.1脲酶活性的测定
脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应：
H2NCONH2 + H2O →2NH3 + CO2
在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。脲酶含有镍，分子量在151，000～480，000Da之间。能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。
NH4+释放量法
方法原理 通过对新鲜土壤与尿素溶液在37ºC培养2h后测定氨释放量，估计脲酶的活性。
结果计算
脲酶的活性（单位时间内铵态氮的释放量，N mg kg-1h-1） = C*V*k*14/（m*K*2）*1000
式中：
C：标准溶液的浓度，mol L-1；V：标准溶液的体积，mL；k：分取系数；14：氮的摩尔质量，mgmmol-1； K：水分系数；2：培养时间，2 h；m：样品质量，g。
注意事项
与其他缓冲液（如磷酸盐绥冲液）相比，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液优点在于它能够有效地防止铵的固定。在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调pH，因为后者能够促进脲酶的活性。
8.4.2磷酸单酯酶活性的测定
磷酸酶是土壤中广泛存在的一种水解酶，能够催化磷酸酯的水解反应，包括磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯酶等。其中，磷酸单酯酶由于与有机磷的矿化及植物的磷素营养关系密切，因此是研究*多的磷酸酶。磷酸单酯酶又基于其反应的*适pH值，分为酸性（pH5～6）和碱性磷酸酶（pH8～10）。磷酸单酯酶能够催化ß-甘油磷酸酯、苯磷酸酯、ß-萘磷酸酯、硝基苯磷酸酯等的水解。磷酸根的存在对磷酸单酯酶的活性有竞争抑制作用。此外，重金属和微量元素也抑制磷酸单酯酶的活性。测定磷酸单酯酶活性的方法有很多，这些方法的区别主要体现在所用的底物不同，以及由此产生的测定水解产物的方法各异。目前常用的是用对硝基苯磷酸脂法测定磷酸单酯酶的活性，用双对硝基苯磷酸脂法测定磷酸二酯酶的活性。
对硝基苯磷酸盐法
方法原理测定磷酸单酯酶是基于该酶能够水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估计磷酸单酯酶的活性。酸性和碱性磷酸酶的活性可通过控制反应的pH值来分别测定。测定酸性磷酸酶活性时，溶液的pH为6.5，碱性磷酸酶的pH为11。
结果计算
磷酸单酯酶活性（单位时间内对硝基苯酚的产生量，C6H5NO3 mgkg-1 h-1）= m1/（m2*K）*1000
式中：
m1：测试溶液中对硝基苯酚的质量，mg；m2：样品质量，g；K：水分系数。
注意事项
为消除土壤浸出液颜色的影响，应做对照。
8.4.3磷酸二脂酶活性的测定
双对硝基苯磷酸盐法
方法原理 通过用比色法测定磷酸二酯酶水解双p-硝基苯磷酸脂反应后释放的对硝基苯酚的量，来估计其活性。
结果计算
同对硝基苯磷酸盐法。
注意事项
为消除土壤浸出液颜色的影响，应做对照。
