中华中医药学刊
慢性应激对2 型糖尿病大鼠HPA 轴紊乱及海马损伤的影响
杨蕙1，王宇红2，张秀丽2，尹玲桃1，孟盼2
( 1． 湖南中医药大学**附属医院，湖南长沙410007; 2． 湖南省中药粉体与****省部共建国家重点实验室培育基地，湖南长沙410007)
摘要: 目的: 探讨慢性应激对2 型糖尿病大鼠HPA 轴紊乱及海马损伤的影响。方法: 采用高脂灌胃联合尾
静脉注射链脲佐菌素( STZ) 的方法制备2 型糖尿病动物模型并随机分为两组: 一组给予慢性应激3 周，另一组不进行慢性应激; 同时以空白对照组及慢性应激组为对照。造模结束后，Morris 水迷宫测定动物空间学习记忆能力; ELISA 法测定血浆皮质酮( COＲT) 、促肾上腺皮质**( ACTH) 、促肾上腺皮质**释放**( CＲH) 水平; HE染色观察海马、下丘脑、垂体和肾上腺形态学变化。结果: 与正常组比较，糖尿病组、慢性应激组及糖尿病联合慢性应激组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期( EL) 延长，空间探索时间( SET) 缩短; 血浆COＲT、ACTH、CＲH 水平升高; 海马、下丘脑、垂体和肾上腺形态结构呈现不同程度的器质性改变; 但是糖尿病联合慢性应激组大鼠各项指标变化程度具有显著性意义( P ＜ 0． 05) 。结论: 慢性应激可导致糖尿病大鼠HPA 轴紊乱及海马损伤，大鼠学习记忆能力受损可能与此有关。
关键词: 2 型糖尿病; 慢性应激; HPA 轴; 海马
中图分类号: Ｒ － 332 文献标志码: A 文章编号: 1673-7717( 2014) 11-2660-04
糖尿病是一种体内胰岛素分泌**或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱的**。2010 年世界卫生组织调查显示，全世界约2.85 亿糖尿病( diabetes mellitus，DM) 病人，比2007 年增加1.56 亿，2030 年预计可达4. 39 亿［1］。糖尿病已成为继心脑血管病、癌症之后的第三大杀手。糖尿病的病因及发病机理较为复杂，至今尚未完全阐明［2］。近年来，在生物－ 心理－社会新的医学模式下，糖尿病被认为是与心理因素密切相关的心身**，但对心理应激在糖尿病的发生、发展、转归中所起的作用还没有达到统一的认识。随着应激对糖尿病影响研究的逐步深入，精神因素和应激事件对糖尿病的影响也越来越为人们所重视［3］。研究表明，外界应激主要通过影响机体***紊乱而加重糖尿病的病情。由于应激可影响机体的**神经系统，如海马［4］，而**神经系统对***，尤其是HPA 轴具有调控作用［5］，因此推测，慢性应激可通过影响机体海马结构与功能，致***紊乱，HPA轴亢进，进一步影响糖尿病的病程。本实验通过给予2 型糖尿病大鼠慢性温和不可预知性应激，探讨糖尿病大鼠学习记忆能力，HPA 轴***指标及重要脏器的病理改变，为现代社会糖尿病的发**展提供新的研究思路。
1 实验材料与方法
1． 1 药品与试剂
链脲佐菌素( STZ) 由索莱宝公司提供; 高脂乳剂组成:10% 胆固醇、0． 2% 丙硫氧嘧啶、20% 猪油、2% 胆酸钠、20%吐温－ 80、20%丙二醇、加蒸馏水至100 mL 配制而成。COＲT、ACTH、CＲH 试剂盒由ＲD 提供。
1． 2 实验仪器
DB001Morris 水迷宫，北京智鼠多宝生物科技有限责任公司; MK3 型酶标仪，Thermo，美国; ET － 12P 组织脱水机，江西富华生物技术有限公司; ＲM223 切片机，德国莱卡;DVP －W7 显微镜图像处理系统，南京长城信息系统公司。
1． 3 动物模型的建立及分组
SPF 级雄性SD 大鼠50 只， 180 ～ 200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号: SCXK( 湘) 2009 －0004; 合格证号: HNASLKJ20102728。除空白组及慢性应激组以外，其余大鼠均以高脂乳剂10 mL/kg 连续灌胃14 d，每天1 次。末次灌胃高脂乳剂后，大鼠禁食不禁水24 h，一次性尾静脉注射链脲佐菌素( STZ，溶于新鲜配制的0． 1mol /L，pH = 4． 5 枸橼酸缓冲液中，4 ℃保存) 38 mg /kg，正常对照组1 次性尾静脉注射0． 1 mol /L，pH = 4． 5 枸橼酸缓冲液，注射体积为2 mL/kg。造模72 h 后，所有大鼠禁食不禁水7 h，测定空腹血糖，从中选取空腹血糖≥16． 00 mmol /L 的大鼠为2 型糖尿病模型。糖尿病模型大鼠随机分为2组，分别为糖尿病组，糖尿病加21 d 慢性应激组，以正常组和慢性应激组为对照，每组8 只。慢性应激包括4 ℃冰水浴5 min， 45 ℃热刺激5 min，倾笼45° 24 h，噪音8 h，昼夜
颠倒24 h，潮湿垫料( 200 mL/笼， 24 h) ，夹尾1 min。每天采用一种刺激，同种刺激不连续出现。造模结束后进行Morris 水迷宫实验，实验结束后取血测定血浆皮质酮( COＲT) 、促肾上腺皮质**( ACTH) 、促肾上腺皮质**释放**( CＲH) 水平，HE 染色观察海马、下丘脑、垂体和肾上腺形态学变化。
1． 4 指标测定
1． 4． 1 Morris 水迷宫Morris 水迷宫被均分为A、B、C、D 4个象限。训练前，水迷宫内盛自来水，加墨汁使水变漆黑，检测前将平台置于D 象限水面下2 cm，使其在实验光线下对大鼠不可见。所有实验均在9 ∶ 00 － 15 ∶ 00 之间进行，且保持室内安静，物品放置及灯光状态一致，水温( 24 ± 1)℃。第1 ～ 4 d 定位航行实验: 按逆时针方向分别从A、B、C、D 4 个象限将大鼠面向池壁放入水中，观察并计时60 s，检测前将平台置于D 象限正中水面下2 cm。摄像系统记录大鼠寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期( evasive latency，EL) ，若60 s 内还未找到平台，则引导其至平台，停留15s，逃避潜伏期记为60 s。实验结束后以4 d 的逃避潜伏期曲线反映大鼠的学习能力。第5 d 空间探索实验: 撤除平台，将大鼠从距原平台*远的B 象限面向池壁放入水中，摄像系统记录大鼠在60 s 内各象限游泳时间，以在原平台所在D 象限游泳时间即空间探索时间( space explorationtime，SET) 作为记忆成绩。
1． 4． 2 血浆指标测定10% 水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉下行腹主动脉取血， 2500 r /min 离心15 min 取血浆保存于－ 80℃ 冰箱，严格按照ELISA 试剂盒说明书测定血浆COＲT、ACTH、CＲH 含量。
1． 4． 3 组织病理学检测大鼠取血后，摘取大脑，垂体，肾上腺，立刻经4% 福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，光学显微镜下进行组织形态学观察。
1． 5 统计学处理
采用SPSS 11． 0 进行统计学分析。多组间比较用方差分析，每组两两比较用q 检验，数据以珋x ± s 表示。
2 实验结果
2． 1 Morris 水迷宫实验定位航行实验中，与正常组比较，糖尿病组、慢性应激组和糖尿病联合慢性应激组大鼠的逃避潜伏期均随着训练时间的延长而有不同程度的延长( P ＜ 0． 05) ; 当实验进行到第4 d，糖尿病联合慢性应激组大鼠较糖尿病组和慢性应激组的逃避潜伏期显著延长( P ＜ 0． 05) ，即学习能力*差。空间探索实验中，与正常组比较，糖尿病组、慢性应激组和糖尿病并发抑郁症组的探索时间均有不同程度的缩短，其中慢性应激组和糖尿病并发抑郁症组时间缩短具有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。结果表明，慢性应激或糖尿病均可在一定程度上导致大鼠学习记忆能力受损，但糖尿病联合慢性应激后，大鼠学习和记忆能力衰退*为明显，结果见表1。
2． 2 血浆COＲT、ACTH、CＲH 含量测定与正常对照组比较，糖尿病和慢性应激大鼠血浆COＲT、ACTH、CＲH 水平均显著升高( P ＜ 0． 05) 。与糖尿病组和慢性应激组比较，糖尿病联合慢性应激组大鼠血浆
COＲT、ACTH 水平显著升高( P ＜ 0． 05) ，CＲH 水平仅稍有升高( P ＞ 0． 05) 。结果表明糖尿病大鼠体内存在HPA 轴亢进，**分泌紊乱的现象，慢性应激会进一步恶化HPA轴紊乱，结果见表2。
2． 3 大鼠海马，下丘脑，垂体，肾上腺病理检测
2． 3． 1 大鼠海马形态学变化正常大鼠海马椎体细胞正常排列，形态正常。糖尿病组、慢性应激组和糖尿病联合慢性应激组大鼠椎体细胞均可见不同程度的胞体固缩，深染及空泡变性，表明海马细胞存在一定程度的损伤。其中糖尿病联合慢性应激组病变*为明显，结果见插页Ⅶ图1。
2． 3． 2 大鼠下丘脑形态学变化正常对照组大鼠下丘脑细胞分布均匀，细胞呈圆形，核/质比例等形态正常。糖尿病组、慢性应激组和糖尿病联合慢性应激组大鼠神经元胞体增大，部分出现空泡样变性，提示下丘脑分泌处于亢进状态。其中糖尿病组与糖尿病联合慢性应激组病变程度相似，均大于慢性应激组，结果见插页Ⅶ图2。
2． 3． 3 大鼠垂体形态学变化正常对照组大鼠垂体嗜酸性细胞和嗜碱性细胞分布均匀，分泌ACTH 的嗜碱性细胞分布均匀，形态正常。糖尿病组、慢性应激组和糖尿病联合慢性应激组大鼠垂体均出现不同程度的嗜碱性细胞数量增多，细胞体积增加，细胞核深染，窦状****增多，提示腺垂体分泌处于亢进状态。其中糖尿病联合慢性应激组病变程度*为严重，结果见插页Ⅶ图3。
2． 3． 4 大鼠肾上腺形态学变化正常对照组大鼠肾上腺球状带和束状带分界清晰，分泌糖皮质**的束状带细胞排列整齐。糖尿病组、慢性应激组和糖尿病联合慢性应激组大鼠肾上腺球状带和束状带分界模糊，束状带细胞数量增多，体积增大，胞浆空泡增多，提示肾上腺分泌处于亢进状态。其中糖尿病联合慢性应激组束状带细胞病变*为严重，结果见插页Ⅶ图4。