百萤为您推荐用于筛选GPCR和钙离子通道靶标的荧光探针

钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的**发现中的优选方法。

百萤生物为您推荐由AAT研发的Quest Rhod-4™钙检测试剂/试剂盒，它是市场上受欢迎的红色荧光探针Rhod-2的上乘替代品。

Rhod-2是近年来市场上*受欢迎的红色荧光Ca2 +指示剂，可*大限度地减少化合物的自发荧光干扰。此外，其细胞中的线粒体定位和高基础Ca2 +信号严重限制了其细胞应用。但是，在488nm处对Rhod-2的不太理想的激发使得其与仅具有488nm激发光源的一些仪器一起使用时不太理想。AAT Bioquest研发的Quest Rhod-4™系列钙检测试剂，可以解决Rhod-2的这些局限性。 Quest Rhod-4™除了具有514 nm，532 nm和546 nm激发外，还可以使用488 nm的氩离子激光进行激发，这是非常独特的。其主要的细胞溶质定位，长多波长激发和> 100倍荧光增强（与钙形成复合物）的特点使得Quest Rhod-4™成为测量细胞钙的理想指标，特别是当文库化合物具有强荧光时并且应用程序需要GFP的时候。我们的Quest Rhod-4™AM比细胞中的Rhod-2 AM亮4倍以上。这一特性使Screen Quest™Rhod-4™更适合HTS应用。

Screen Quest™Rhod-4钙测定流程图

下图为，通过Gq或钙通道增加细胞溶质中的[Ca2 +]使用Rhod-4的强荧光来测量。

Rhod-2与Rhod-4的比较

图1.在96孔黑壁/透明底板中，将U2OS细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。 除去生长培养基，将细胞与100μl5μMRhod-4AM或Rhod-2AM在HHBS中于37℃温育1小时。 用200μlHHBS洗涤细胞两次，然后使用FITC通道用荧光显微镜（Olympus IX71）成像。

图2.在HEK-293细胞中筛选Quest ^TM Rhdo-4AM和Rhod-2AM的比较。 将HEK-293细胞在96孔黑壁/透明底板中以每100μl/孔40,000个细胞接种过夜。 除去生长培养基，将细胞与100μl5μMRhod-4AM或Rhod-2AM在HHBS中于37℃温育1小时。 然后用2次HHBS洗涤细胞。 NOVOstar（BMG Labtech）添加30μMCarbachol（50μl/孔）

图3.HEK-293细胞中的卡巴胆碱剂量反应。 将HEK-293细胞以每孔100μL每孔40,000个细胞接种过夜，在96孔黑色壁/透明底板中。 除去生长培养基，将细胞与100μl的Screen Quest ^TM Rhod-4 NW钙测定试剂盒或5μMRhod-2 AM在37℃，5％CO 2培养箱中温育1小时。 通过NOVOstar添加卡巴胆碱（25μl/孔）以达到*终指示的浓度。 EC50为0.8μM，与文献中的结果相似。

图4. CHO-K1细胞中的ATP剂量反应。 将CHO-K1细胞以60,000个细胞/100μl/孔接种过夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生长培养基，将细胞与100μl的Screen Quest ^TM Rhod-4 NW钙测定试剂盒或5μMRhod-2 AM在37℃，5％CO 2培养箱中温育1小时。 通过NOVOstar添加卡巴胆碱（50μl/孔）以达到*终指示的浓度。 EC50为0.6μM，与文献中的结果相似。

图5. Screen Quest™Rhod-4 NW钙测定试剂盒，刀豆蛋白A上的Rhod-2 AM与JurKat细胞诱导Ca进入（电容钙进入（CCE））的比较。 将Jurkat细胞以每毫升4X106个细胞悬浮在无钙HHBS缓冲液中，将细胞与等体积的Rhod-4 NW或Rhod-2 AM在无钙HHBS缓冲液中以2×10 5个细胞/孔/100μL在96℃下孵育。 井黑墙/透明底板，在37℃，5％CO2培养箱中1小时。 在10分钟孵育结束时，将具有/不具有30μM的通道抑制剂SKF96365的1μg/ ml的通道开放剂伴刀豆球蛋白A加入细胞中。 NOVOstar（BMG Labtech）添加50μL/孔的HBSS和另外的24mM（5X）钙（因此*终钙浓度为5mM）

Rhod-4特点

细胞溶质定位：Quest™Rhod-4 AM主要定位于胞质溶胶中，而Rhod-2 AM定位于线粒体中;

多种激发： ~490 nm，514 nm，532 nm和546 nm;

信号强度高：在Ex 530 / Em 570下比Rhod-2 AM亮4倍。

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