基因克隆与定点突变|实验技术服务

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测序实验流程：
定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
定点突变的比较有特色的产品还有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物(同一方向，对同一单链模版)，一条包含计划定点突变的序列，另一条引物包含质粒上某一个单酶切位点，不过在单酶切位点中引入突变，这样两条引物除了所包含的突变位点，其他序列和质粒上对应位置的序列完全一致，退火后和质粒模版结合，通过T4 DNA聚合酶延伸，延伸反应持续直到碰到另一条引物停止，两段包含突变位点的延伸产物经T4连接成环，和模版链组成杂和环，带有两处错配。单酶切反应产物，直接转化Ecoli BMH 71-18 mutS(错配修复缺陷株)。原来的双链质粒模版被切开而不能转化，而杂和质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开，保持环状质粒得以转化。转化子的杂和双链在E.coli的复制过程中分开，再经过一轮提质粒、单酶切、转化，*后得到纯和的突变质粒。这个试剂盒则是利用改造单酶切位点使得新合成的突变质粒不被切开从而除去原来的模版质粒。
有的时候研究可能需要多个位点的定点突变，比如改造酶的活性或者动力学特性，研究蛋白之间的相互作用位点等，单点突变不能满足实验的需要，重复进行单点突变也非常浪费时间。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。*多一次实验可以引入5个定点突变。这个试剂盒的原理和Clontech的相似，就是准备多个带突变的引物(同方向，对同一单链模版)，退火后全部突变引物(不超过5个)都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环(mutant ssDNA)，得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒(因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能)。
流程
定点突变一般须有含有待突变基因的高纯度质粒，不少于10μg，电泳图清晰，达酶切及测序要求;
1.对待突变基因测序结果进行分析，设计突变方案;
2.根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应;
3.默认情况下，将PCR产物克隆至T载，或者根据要求亚克隆至目的载体;DNA测序验证突变序列的正确性。