凝胶迁移或电泳迁移率(EMSA)技术服务|实验技术服务

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凝胶迁移或电泳迁移率(EMSA)技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
利用凝胶进行的电泳迁移率变动分析。不同大小的分子在凝胶中电泳移动的速度不同，当某种分子与另一种分子特异性结合后，它在非变性凝胶电泳带中的位置就发生了变化，由此可以分析不同分子间的相互作用。如待检测DNA样品与核蛋白提取物孵育后进行电泳，如果核蛋白提取物中存在能与DNA特异结合的蛋白质，由于大分子复合体的形成，电泳时就出现迁移率降低，区带滞后的现象。
1. 制胶 必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.
10X TBE 1.0ml
40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml
50% Glycerol（50%甘油） 1.0ml
dH2O（蒸馏水） 14.8ml
TEMED（四甲基乙二氨） 20µl
脱气10min
10% AP（过硫酸氨） 120µl
总量 20.0ml
2. 一般试剂盒包括的试剂
l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC)
l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC)
l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC)
l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC)
l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC)
l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC)
l 2×Blocking Buffer（2× 封闭液）(4 oC)
l 5×Washing Buffer（5× 洗涤液）(4 oC)
l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC)
l Binding-membrane（结合反应膜）(RT)
3. 结合反应
每次结合反应需1-5µl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15µl
（1） 结合反应体系：
10X 结合反应液 1.5µl
Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0µl
细胞核提取物* ? µl
双蒸水* ? µl
混匀室温静置20 分钟
生物素标记的探针 0.5µl
总量 15µl
混匀室温静置20分钟或以上。
（2）特异性反应确认竞争反应体系：
10X 结合反应液 1.5µl
Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0µl
细胞核提取物 ? µl
未标记的竞争性寡核 2.0µl
双蒸水* ? µl
混匀室温静置20 分钟
生物素标记的探针 0.5µl
总量 15µl
混匀室温静置20分钟或以上。
其中:
探针用量: 这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是*少50fmol.
蛋白样品用量: 一般用量在2---20ug(控制在1-5µl)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.