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明胶酶谱技术服务|实验技术服务

日期:2024-12-24 09:31
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摘要:关键词:明胶酶谱技术服务|实验技术服务 简介:世界****明胶酶谱技术服务|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。 明胶酶谱技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。 我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。 产品品牌:明胶酶谱技术服务|实验技术服务 http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html 测序实验流程: 酶谱...
关键词:明胶酶谱技术服务|实验技术服务
简介:世界****明胶酶谱技术服务|实验技术服务原装**,质量保证,价格优惠。
明胶酶谱技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧,承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信,我们提供原始的表达菌株和克隆质粒,客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌:明胶酶谱技术服务|实验技术服务   http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程:
酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,*后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
试剂的配制
(1)配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(含1.0mg/ml 明胶,配好后1周内使用,明胶含量低灵敏度高)
A.分离胶的配制(注:根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量)
10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 10ml(包括)
ddH2O 4.5ml
30%储备胶(0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺) 2ml
1.5mol/l Tris(PH 8.8) 2.5ml
10% SDS 100u
10%过硫酸铵(APS) 100ul
TEMED 8ul
1%明胶(1g明胶-->100ml,37°C水浴溶解) 0.5ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶 6ml
ddH2O 4.5ml
30%储备胶 0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml
10% SDS 60ul
10%过硫酸铵 60ul
TEMED 6ul
(3)5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL,1.25mol/l 甘氨酸,0.5%SDS(PH 8.3)
(4)4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS(PH7.2) 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚蓝 0.024g
ddH2O 2.4ml
(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100,50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ,5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>,pH7. 6 (40分钟两次,中间换液)
(6)漂洗液: 50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L CaCl2,pH7. 6 (20分钟2次)
(7)孵育液:50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3(孵育42小时)
(8)染色液:0.05% Coomassic 亮蓝 R-250,30%甲醇,10%乙酸(染色3小时)
(9)脱色液A、B、C:甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% (分别30min、1h、2h脱色)
实验步骤
1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
2.次日收集上清液,将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min,-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度(或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致)。与5×上样缓冲液混合,13ul样本+4ul上样缓冲液。(不要用枪用力吹打,防止出现过多气泡)
4.配制分离胶和浓缩胶,16ul/孔上样(根据表达强度和蛋白浓度确定上样量),4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时(电泳时在周围敷上冰,有利于使条带跑直)。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100,50mmol/L Tris -HCl ,5mmol/L CaCl2,pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后,显示出MMP-2(72KD) 和MMP -9(92 KD)为位于蓝色背景上的透亮带,用凝胶图像分析系统分析读取条带面积,宽度和灰度值,做统计分析。
注意事项
1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。
2.明胶酶谱的活性受钙离子,锌离子,和PH值等因素的影响,因此缓冲液 配制应严格准确,尽量用超纯水,孵育温度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH*好在7.5-7.6,复性的TRITON时间长了会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培养箱中,因为会改变孵育液的PH值,在普通孵箱即可。
6.明胶要4度保存,配好后1周内使用
凝胶制备
1.玻璃板对齐后放入夹中,垂直卡紧,加满水检漏。
2.配10%分离胶,APS和TEMED作用为促凝,*后灌胶前加。若板不漏水,则将水倒出,并用吸水纸洗净后灌胶,灌至大约3/4处,上面加满水压平。
3.配浓缩胶,同样地,APS和TEMED*后加,分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝,同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线,说明胶已凝固。
4.将上面的水倒去,吸水纸洗净,灌入浓缩胶,灌满,注意一定不要有气泡,然后将梳子插入,注意保持水平,约30min后凝固可用。
5.拔梳子在电泳缓冲液中拔,加样孔用小针筒冲洗干净再上样,注意上样时勿使样品逸至邻孔,样品混匀时要轻,不要产生气泡,否则加样时易导致逸出而使结果不准确。