贴心小NOTE

贴心小NOTE

Note1：如果需要减少反应过程中高浓度的抗体（100000ng/ml）对酶标板材的非特异吸附，在包被过程中，建议选择疏水性酶标板材（polysorp）,包被的抗原浓度需要少量0.2-1ug/ml，具体情况需要根据抗原抗体的亲和力大小来进行判断优化。一般来说亲和力越强，所需的抗原包被浓度越低。

Note2：封闭液不一定能起到封闭效果，需要实验验证（未包被抗原的分组），一般来讲分子量越小的封闭剂效果越佳。

Note3：在方法学开发的初期可以拉大一下标准曲线的浓度范围100000ng/ml-0.1ng/ml，以得到有明显上下平台期的全曲线，当抗原抗体间亲和力较强时，梯度浓度可缩小，稀释的倍数可在方法学优化过程中缩小至2倍。

Note4：酶联抗体效应过量，酶联抗体的稀释需要做不同的稀释度进行比较选择，对于单抗成分的酶联抗体，如果高低两个稀释度的酶联抗体能够产生一样的剂量曲线，说明酶联抗体过量，ELISA的信号传递未产生偏差。

对于多抗成分的酶联抗体，其稀释度的判断较为复杂，可以初略计算下酶联抗体的摩尔浓度要高于包被上的抗原摩尔浓度的5倍以上。当酶联抗体浓度较小时，酶联抗体在高剂量不同浓度的抗体条件下均被抓到，曲线有假上平台。

Note5：对于吸光度值底物和荧光底物，仪器检测的信号值和显色时间成正比，控制在10-30分钟为宜。需要提前确认检测仪器的信号线性范围，比如一般的酶标仪吸光度值的信号线性范围在0-3，吸光度值在3-4之间为非线性的，在显色时应控制信号值不要超过3，当信号值超过线性范围时，曲线有假上平台。

Note6：不同底物需要用不同的仪器进行检测，吸光度读值，荧光读值，化学发光读值。在底物选择过程中注意实验室的酶标仪是否具备该种类型的读数功能。

Note7：标准的剂量曲线拟合一般用四参数拟合，需要有明显的上下平台期（A，D值），斜率一般在0.8-1.2（B值）之间，EC50（C值）即为抗体相对于抗原的亲和力值。