PCR反应RNA质量检测过程

RNA质量检测过程：

1.  紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

（1）浓度测定

A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：

RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260 = 0.21

RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：

35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

（2）纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定

（1）制胶

1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10x MOPS电泳缓冲液

浓度  成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸钠

0.01 M  EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

（2）准备RNA样品

取3 ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

（3）电泳

上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。

（4）紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。