PCR引物的延伸解读

    DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的zui 适温度, 一般为70～75℃。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。一般在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒,其速度取决于缓冲溶液的组成、ph值、盐浓度与DNA模板的性质。

     PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应zui 终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%。反应初期，目的DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应。

    PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。引物如果跟原始DNA模板结合，从3'端开始扩增延伸，其产物的5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。引物如果是以新合成的DNA链（即“长产物片段”）为模板扩增时，模板的5'端序列是固定位置的，即新合成延伸链的3'端是固定的，使新合成DNA链的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。由于新合成的DNA链在下一个循环反应中可以作为引物结合扩增的模板，“短产物片段”是按指数倍数增加。而原始DNA模版的量是固定的，“长产物片段”只按算术倍数增加，在zui 终PCR中的含量几乎可以忽略不计。

   一般PCR反应包括上述变性-退火-延伸三个温度点。但在扩增某些较短目标序列（长度为100～300bp时）时，可采用二温度点法，即把退火与延伸温度合二为一。