普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计差异
普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别
一、方法不同
1、普通pcr引物设计：引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
2、荧光定量pcr引物设计：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度
二、原理不同
1、普通pcr引物设计：为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
2、荧光定量pcr引物设计：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
三、注意事项不同
1、普通pcr引物设计：引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度在15~30碱基之间。
3、荧光定量pcr引物设计：实时荧光定量 PCR 仪应安放在湿度较低、灰尘较少、远离水池的平稳台面上，不能有强光直射，室内应通风良好，无腐蚀性气体 。
假阳性是指出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
产生的原因有：
①引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的序列；
②靶序列太短或引物太短；
③靶序列或扩增产物的交叉污染。
解决方法有：操作轻柔，防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外造成污染；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材高压消 毒；离心管及加样枪头等一次性使用。必要时，可在加标本前，将反应管和试剂用紫外光照射，以破坏存在的核酸。