PCR反应没有目的片段考虑方面

日期：2025-01-08 22:45

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摘要：PCR反应没有目的片段考虑方面: 1. 含有PCR反应抑制物对样本稀释(l: 100 和1:1000) 后再扩增，并通过在已知阳性模板中加入原始PCR 混合物进行扩增，验证抑制物的存在； 2. 模板浓度太低，扩增循环数不够尽可能降低退火温度，在降落PCR 的低温度增加10个扩增循环； 3. 非特异扩增增加起始模板的变性温度(通常为95℃ 5min)，采用降落PCR和热启动PCR 4. 扩增反应混合液中各成分浓度不对改变TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的浓度及缓冲液的pH 5. 原始模板浓度太低使用巢式引物...

PCR反应没有目的片段考虑方面:

1. 含有PCR反应抑制物

对样本稀释(l: 100 和1:1000) 后再扩增，并通过在已知阳性模板中加入原始PCR 混合物进行扩增，验证抑制物的存在；

2. 模板浓度太低，扩增循环数不够

尽可能降低退火温度，在降落PCR 的低温度增加10个扩增循环；

3. 非特异扩增

增加起始模板的变性温度(通常为95℃ 5min)，采用降落PCR和热启动PCR

4. 扩增反应混合液中各成分浓度不对

改变TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的浓度及缓冲液的pH

5. 原始模板浓度太低

使用巢式引物对第1次扩增产物进行稀释（l :100 和1:1000)后扩增；

6. 扩增需要增强剂

加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亚枫CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增强剂

7. 引物设计存在问题

重新设计引物