双抗夹心法实验操作注意事项

双抗夹心法实验操作注意事项：

1、样品稀释：

（1）稀释血清避免假阳性的发生（把蛋白按照一定的倍数稀释，如10倍、20倍，将抗原进行稀释包被反应；用稀释好的阳性参阅血清和阴性参阅血清进行孵育后洗刷，加入酶结合物进行反应，孵育洗涤，加入底物显色，停止反应后分别测定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀释度为适合的包被浓度。阴性参阅血清O.D值<0.1-0.2。这样阳性参阅血清和阴性参阅血清的O.D值就会有明显差别）。

（2）粉末型样本需要短暂离心，如沾到管盖、管壁需要将标准品沉入管底；加入蒸馏水时需短暂轻柔涡旋，静置10-30min，充分溶解。

（3）加水后等待充分溶解后可选择吸吹或涡旋混匀。

2、试剂平衡：

（1）所有的试剂和样本需平衡至室温5-10min，避免产生动力学反应差异这会影响准确性。

3、混匀：

（1）稀释前、后的样品需进行摇床充分混匀。

4、加样操作：

（1）定期校准移液抢。

（2）加样前需混匀，避免加入到孔壁上，尽可能避免气泡产生。

（3）避免样本溅出（可用吸水纸吸取溅出液体）。

（4）避免加样枪头反复吸取导致样本污染。

（5）加样操作按照说明书的顺序来进行，确保显色时间一致。

5、孵育：

（1）震荡孵育，加快抗原抗体之间的相互接触，使反应更加充分。

（2）水浴温度保持37℃。

（3）水浴需要封闭防止污染。

6、洗板：

（1）洗液尽量不要溢出孔外。

（2）拍过酶标记物后及时更换吸水纸，避免影响实验的准确性。

（3）手工洗板时拍板要垂直且用力不能过猛，可避免交叉污染。

（4）扣干后的酶标板应快速加液，避免干板太久。

（5）采用全自动时需检查各项水瓶是否充足。

（6）采用全自动时检查是否堵塞。

7、显色：

（1）显色需控制好时间（根据说明书操作）,时间过短,结果偏低；时间过长,空白增高/非特异性显色增加。

（2）显色呈梯度。

8、比色：

（1）跟换滤光片时注意错用的可能性。

9、检测：

（1）酶标仪使用前预热10-15min，结果更稳定。

（2）双波长测定吸光值，可以减少指纹、杂质等带来的误差（检测波长450nm-参考波长630nm(570nm)）。