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原代细胞取材的基本要求
细胞的来源多样,培养方法也各不相同,凡是来源于胚胎、组织器官及外周血,经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化,经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群,称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础,只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法,本章重点叙述常用的基本技术。
人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件,是进行细胞培养的**步,若取材不当,将会直接影响细胞的体外培养,现将取材的基本要求和注意事项叙述如下:
(1)取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功,取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞,尽快入箱培养,若不能即时培养,应将组织浸泡于培养液内,于4℃存放。若组织块较大,应在**表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后,切碎于培养液内4℃存放,但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、**组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基,按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。
(2)取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行,为了确保无菌,对所取材料若疑有污染的可能,应将所取组织在含高浓度**素(400单位/mL)甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上,再用PBS洗2~3次,以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先**好的带少许培养液(内含400单位/mL**素)的小瓶等便于携带的物品来取材,所取材料应避免接触有毒有害的化学物质,如碘、汞等。
(3)取材和原代细胞制作时,要用锋利的器械,如手术刀或剃须刀片切碎组织,尽可能减少对细胞的机械损伤。
(4)要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,切碎组织时应避免组织干燥,可在含少量培养液的器皿中进行。
(5)取材应注意组织类型、分化程度、年龄等,一般来讲,胚胎组织较成熟个体组织容易培��,分化低的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。
(6)原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录,以备以后查询。
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