如何制备单克隆抗体
单克隆抗体,是单个B**细胞同骨髓肿瘤细胞杂交,产生的针对单一抗原决定簇的抗体,并且该杂种细胞能无限的繁殖。主要原理是:B**细胞能产生抗体,但不能无限分裂,肿瘤细胞在体外能够无限分裂,但不能产生抗体,将两种细胞融合后具有两种细胞的特性。
其制备的主要步骤包括:
1. 抗原制备
**抗原越纯越好,一般如果抗原的来源有限,或性质不稳定,提纯时易变性,或**原性很强,**用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但如果抗原中混杂物很多,则需对抗原进行纯化。
2. **动物
用目的抗原**动物,使细胞产生B**细胞。根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为**动物。小鼠骨髓瘤细胞系来源于BALB/c小鼠,大鼠骨髓瘤细胞来源于LOU/c大鼠。 如小鼠,一般以8-12周龄的雌鼠为宜。
3. 细胞融合
将**细胞和骨髓瘤细胞按一定的比例混合,并加入促融合剂(PEG),使各种**细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞
4. 杂交瘤细胞的选择性培养
目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基, A(氨基蝶呤),HT(次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)。筛选出融合的杂交瘤细胞,在HAT培养基中存货和增殖,未融合的骨髓瘤细胞和**细胞将逐渐死亡。
5. 杂交瘤细胞的筛选及克隆化
筛选即把分泌所需的抗体的杂交瘤孔从众多孔中选出来,也称为抗体检测, 方法有**酶技术和**荧光技术等。克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程,在得到**的抗原杂交瘤后需进行2-3次克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
6. 单克隆抗体的鉴定
单克隆性的确定,包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗**球蛋白重链和轻链的鉴定和单抗纯度鉴定。单克隆理化特性的鉴定。单抗与相应抗原的反应性测定。
7. 单克隆抗体的大量制备
有动物体内诱生法和体外培养法。