人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒
使用说明书
人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒基本原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人NES1抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人NES1与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人NES1抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人NES1抗体与结合在包被抗体上的人NES1结合、生物素与亲和素特异性结合而形成**复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，人NES1浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中人NES1的浓度。
人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒描述:
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英文名称
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Human NES1 (Nesfatin 1) ELISA Kit
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中文名称
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人Nesfatin 1蛋白 (NES1)酶联**吸附测定试剂盒
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货号
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X-EL-H2373c
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种属
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Human/人
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规格
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96T/Kit (8*12 strips) 48T/Kit (8*6 strips)
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检测方法
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双抗体夹心法
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检测范围
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15.625~1000pg/mL
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灵敏度
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9.375pg/mL
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人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒组成：
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中文名称
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英文名称
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规格
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保存
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ELISA酶标板（可拆卸）
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Micro ELISA
Plate(Dismountable)
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8×12 / 8×6*
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4℃/-20℃ #
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冻干标准品
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Reference Standard
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2/1 支*
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4℃/-20℃ #
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标准品&样品稀释液
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Reference Standard &
Sample Diluent
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1瓶 20mL/12mL*
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4℃
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浓缩生物素化抗体
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Concentrated Biotinylated
Detection Ab
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1支 120μL/70μL*
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4℃/-20℃ #
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生物素化抗体稀释液
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Biotinytated Detection Ab
Diluent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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浓缩HRP酶结合物
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Concentrated HRP Conjugate
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1支 120μL/70μL*
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4℃(避光)
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酶结合物稀释液
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HRP Conjugate Diluent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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浓缩洗涤液（25×）
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ConcentratedWashBuffer
(25×)
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1瓶 30mL/16mL*
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4℃
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底物溶液（TMB）
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Substrate Reagent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃(避光)
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反应终止液
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Stop Solution
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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封板覆膜
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Plate Sealer
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5/3 张*
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产品说明书
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Product Description
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1 份
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质检报告
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Certificate of Analysis
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1 份
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特别说明：
*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）
#: 一周内使用可存于4℃，需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.
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人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒检测前准备工作:
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。
3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为8000pg/mL）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：按照稀释方法图例 标准品&样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL标准品：取0.5mL10ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。
4. 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。
5. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。
当日使用。
人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如200μL/管）
1. 在各孔中加入标准品或样品各100μL， 37℃孵育90分钟
2. 加入100μL 生物素化抗体工作液，37℃孵育60分钟
3. 洗涤3次
4. 加入100μL酶结合物工作液， 37℃孵育30分钟
5. 洗涤5次
6. 加入90μL底物溶液， 37℃孵育15分钟左右
7. 加入50μL终止液，立即在450nm波长处测量OD值
8. 结果计算
一、操作因素对ELISA结果的影响ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。
1.加样
2.温育
3.洗涤
4.显色
5.比色
二、灰区的设置通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”（cut-off value，CO值），这是定性**测定结果报告的依据。
三、标本复查ELISA手工检测过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果的差异，因此加大复查力度是保证结果准确性的可靠方法，比如对HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等项目的可疑、弱阳性标本及少见模式的检测结果进行复查。
四、结果判断和报告常用下列几种方法表示结果：
1.定性测定
2.半定量测定 结果一般以滴度表示。
3.定量测定 即用已知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，绘制标准曲线，结果以**量或单位表示。在ELISA定量检测中每一块反应板都必须绘制相应的标准曲线。
注意事项：
A 仔细阅读说明书。
B 检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期，请勿使用。
C 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）。
D 标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存。
E 准备好所有实验额外所需物品，（比如移液器，试管，清洗器，酶标仪）。
F 按说明书将所用试剂平衡至室温，根据检测标本数量确定所需试剂的量。
G 检查试剂盒内每种试剂的贮存条件，保证所有试剂均按照试剂盒内说明书推荐的条件存储。
H 检查不稳定或者变质的试剂溶液（比如沉淀或变色）。有些试剂，比如标准品稀释液或者检测稀释液，可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之前，必需充分混匀。而由于沉淀物的特性，在加入酶标板之前，必需不停搅拌。
I 保证充分的孵育时间和温度。
J 切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。
K 在混合或溶解蛋白溶液时，避免泡沫产生。
L 在实验开始之前，安排好实验流程。
M 在实验开始之前，清洁工作台。
N 若有问题，应与我公司或代理商的技术支持联系
结果判断:
1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒有效期稳定性考察
本试验以Nesfatin 1蛋白 (NES1)为例
1. OD值：
正常保存条件下有效期内和超过有效期2个月所测OD值比较
正常有效期内OD值： 3.251，2.845，2.126, 1.859, 1.463, 1.022, 0.710,
0.08
超过2个月有效期OD值：3.1.7, 2.643, 2.125, 1.796, 1.453, 0.876, 0.432, 0.07
2.回收率：分别于定值血清及血浆中加入一定量的Nesfatin 1蛋白 (NES1)标准品，重复测定并计算其品均值，回收率为测定值与理论值的比率。
正常保存条件下有效期内和过有效期2个月elisa 试剂盒回收率检测结果
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Sample
|
Conditions
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Recovery range(%)
|
Average(%)
|
|
Serum(n=6)
|
normal
|
88-106
|
95
|
|
After 12 month
|
80-100
|
87
|
|
EDTA plasma(n=6)
|
normal
|
88-106
|
97
|
|
After 12 month
|
78-98
|
87
|
3. 线性：分别于定值血清及血浆中加入一定量的Nesfatin 1蛋白 (NES1)标准品，并将标本按1:2,1:4,1:8稀释，线性范围即为稀释后样本中Nesfatin 1蛋白 (NES1)含量的测定值与理论值的比率。
正常保存条件下有效期内和过有效期2个月elisa 试剂盒回线性检测结果
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Sample
|
Conditions
|
1:2
|
1:4
|
1:8
|
|
Serum(n=6)
|
normal
|
81-92%
|
85-90%
|
89-105%
|
|
After 12month
|
80-88%
|
82-87%
|
87-101%
|
|
EDTA plasma(n=6)
|
normal
|
93-104%
|
81-97%
|
91-96%
|
|
After 12month
|
82-95%
|
75-82%
|
74-90%
|
4. 精密度：以样品测定值的变异系数CV表示。CV（%）=SD/meanx100
批内差：取同一批次试剂盒对低值，中值和高值样本进行定量检测，每份样本测定20次，分别计算不同浓度样本的平均值和SD值。
批间差：选取 3 个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定， 每个样本使用同一试剂盒重复测定 8 次，分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。(批内差： CV<10%;批间差： CV<11%)
正常保存条件下有效期内和过有效期2个月elisa 试剂盒回精密度检测结果
Intra-assay precision
|
Conditions
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
|
sample
|
1
|
1
|
2
|
2
|
3
|
3
|
|
n
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
|
Mean(ng/ml)
|
16.68
|
14.22
|
70.25
|
62.36
|
369.75
|
327.88
|
|
SD
|
1.08
|
1.25
|
4.21
|
5.31
|
24.69
|
32.87
|
|
CV(%)
|
6.5
|
8.8
|
6.0
|
8.5
|
6.6
|
10
|
|
Conditions
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
normal
|
After 12month
|
|
Sample
|
1
|
1
|
2
|
2
|
3
|
3
|
|
n
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
|
Mean(ng/ml)
|
18.72
|
13.68
|
65.98
|
61.25
|
387.22
|
425.26
|
|
SD
|
1.45
|
1.52
|
4.83
|
5.18
|
28.49
|
36.87
|
|
CV（%）
|
7.7
|
11.1
|
7.3
|
8.5
|
7.3
|
8.7
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人Nesfatin 1蛋白 (NES1)试剂盒会出现的问题及解决办法：
1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。
a.原因：未加入酶标记物。
解决办法：请按照操作步骤进行。
b.原因：试剂盒内容物未能充分回。
解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。
c.原因：室温太低。
解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。
d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。
解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。
e.原因：试剂盒已过有效期限。
解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。
2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。
a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。
解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。
b.原因：操作时间拖太久。
解决办法：请在方法熟练后再进行操作。
c.原因：微孔间相互污染。
解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。
d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。
解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。
e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。
解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。
f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。
解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。
3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。
a.原因：室温太高(>25℃)。
解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。
b.原因：底物溶液受到污染。
解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。
c.原因：反应时间超过太久。
解决办法：请控制反应时间。
d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。
解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)
4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。
a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。
解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。
b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。
解决办法：请参考2-f.
c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。
解决办法： 请参考2-d.
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