大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒

大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒

使用说明书

预期应用

本试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)含量。

大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒基本原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)抗体与结合在包被抗体上的大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)结合、生物素与亲和素特异性结合而形成**复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)的浓度。

描述:

成：

大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒检测前准备工作:

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。

3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：按照稀释方法图例 标准品&样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL标准品：取0.5mL10ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。 

4. 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。

5. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。

当日使用。

大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如200μL/管）

1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC溶解。

2.标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

1. 在各孔中加入标准品或样品各100μL， 37℃孵育90分钟

2. 加入100μL 生物素化抗体工作液，37℃孵育60分钟

3. 洗涤3次

4. 加入100μL酶结合物工作液， 37℃孵育30分钟

5. 洗涤5次

6. 加入90μL底物溶液， 37℃孵育15分钟左右

7. 加入50μL终止液，立即在450nm波长处测量OD值

8. 结果计算

一、操作因素对ELISA结果的影响ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。

1.加样

2.温育

3.洗涤

4.显色

5.比色

二、灰区的设置通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”（cut-off value，CO值），这是定性**测定结果报告的依据。

三、标本复查ELISA手工检测过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果的差异，因此加大复查力度是保证结果准确性的可靠方法，比如对HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等项目的可疑、弱阳性标本及少见模式的检测结果进行复查。

四、结果判断和报告常用下列几种方法表示结果：

1.定性测定

2.半定量测定 结果一般以滴度表示。

3.定量测定 即用已知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，绘制标准曲线，结果以**量或单位表示。在ELISA定量检测中每一块反应板都必须绘制相应的标准曲线。

大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒会出现的问题及解决办法：

1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶标记物。

解决办法：请按照操作步骤进行。

b.原因：试剂盒内容物未能充分回。

解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

c.原因：室温太低。

解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。

d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。

解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。

e.原因：试剂盒已过有效期限。

解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。

2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。

a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。

解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。

b.原因：操作时间拖太久。

解决办法：请在方法熟练后再进行操作。

c.原因：微孔间相互污染。

解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。

解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。

e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。

解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。

解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。

3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。

a.原因：室温太高(>25℃)。

解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。

b.原因：底物溶液受到污染。

解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。

c.原因：反应时间超过太久。

解决办法：请控制反应时间。

d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。

解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)

4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。

a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。

解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。

b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。

解决办法：请参考2-f.

c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。

解决办法： 请参考2-d.

注意事项：

A 仔细阅读说明书。

B 检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期，请勿使用。

C 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）。

D 标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存。

E 准备好所有实验额外所需物品，（比如移液器，试管，清洗器，酶标仪）。

F 按说明书将所用试剂平衡至室温，根据检测标本数量确定所需试剂的量。

G 检查试剂盒内每种试剂的贮存条件，保证所有试剂均按照试剂盒内说明书推荐的条件存储。

H 检查不稳定或者变质的试剂溶液（比如沉淀或变色）。有些试剂，比如标准品稀释液或者检测稀释液，可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之前，必需充分混匀。而由于沉淀物的特性，在加入酶标板之前，必需不停搅拌。

I 保证充分的孵育时间和温度。

J 切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。

K 在混合或溶解蛋白溶液时，避免泡沫产生。

L 在实验开始之前，安排好实验流程。

M 在实验开始之前，清洁工作台。

N 若有问题，应与我公司或代理商的技术支持联系

大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒结果判断:

1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

 特异性：

本试剂盒用于检测大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)，经检测与其它相似物质无明显交叉反应。

由于受到技术及样本来源的限制，不可能完成对所有相关或相似物质交叉反应检测，因此本试剂盒有可能与未经检测的其它物质有交叉反应。

回收率：

分别于定值血清及血浆样本中加入一定量的大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)（加标样品），重复测定并计算其均值，回收率为测定值与理论值的比率。

线性：

在定值血清及血浆样本内加入适量的大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)，并倍比稀释成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待测样本，线性范围即为稀释后样本中大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)含量的测定值与理论值的比率。

大鼠细胞毒性T**细胞相关抗原4(CTLA 4)酶联**吸附检测试剂盒精密度：
精密度用样品测定值的变异系数 CV 表示。CV(%) = SD/mean×100

批内差：取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测,每份样本连续测定 20 次，分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批间差：选取 3 个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定，每个样本使用同一试剂盒重复

测定 8 次，分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批内差： CV<10%

批间差： CV<12%

稳定性：

经测定，试剂盒在有效期内按推荐温度保存，其活性降低率小于 5%。

为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。

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