小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒

小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒

使用说明书

预期应用

本试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定小鼠血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物液体中生长因子受体结合蛋白2(Grb2)含量。

小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒基本原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)抗体与结合在包被抗体上的小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)结合、生物素与亲和素特异性结合而形成**复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)的浓度。

描述:

组成：

小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒检测前准备工作:

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。

3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为10 ng/mL）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：按照稀释方法图例 标准品&样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL标准品：取0.5mL10ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。 

4. 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。

5. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。

当日使用。

小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如200μL/管）

1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC溶解。

2.标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

1. 在各孔中加入标准品或样品各100μL， 37℃孵育90分钟

2. 加入100μL 生物素化抗体工作液，37℃孵育60分钟

3. 洗涤3次

4. 加入100μL酶结合物工作液， 37℃孵育30分钟

5. 洗涤5次

6. 加入90μL底物溶液， 37℃孵育15分钟左右

7. 加入50μL终止液，立即在450nm波长处测量OD值

8. 结果计算

一、操作因素对ELISA结果的影响ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。

1.加样

2.温育

3.洗涤

4.显色

5.比色

二、灰区的设置通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”（cut-off value，CO值），这是定性**测定结果报告的依据。

三、标本复查ELISA手工检测过程复杂，影响因素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成结果的差异，因此加大复查力度是保证结果准确性的可靠方法，比如对HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等项目的可疑、弱阳性标本及少见模式的检测结果进行复查。

四、结果判断和报告常用下列几种方法表示结果：

1.定性测定

2.半定量测定 结果一般以滴度表示。

3.定量测定 即用已知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，绘制标准曲线，结果以**量或单位表示。在ELISA定量检测中每一块反应板都必须绘制相应的标准曲线。

小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒会出现的问题及解决办法：

1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶标记物。

解决办法：请按照操作步骤进行。

b.原因：试剂盒内容物未能充分回。

解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

c.原因：室温太低。

解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。

d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。

解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。

e.原因：试剂盒已过有效期限。

解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。

2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。

a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。

解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。

b.原因：操作时间拖太久。

解决办法：请在方法熟练后再进行操作。

c.原因：微孔间相互污染。

解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。

解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。

e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。

解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。

解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。

3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。

a.原因：室温太高(>25℃)。

解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。

b.原因：底物溶液受到污染。

解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。

c.原因：反应时间超过太久。

解决办法：请控制反应时间。

d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。

解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)

4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。

a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。

解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。

b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。

解决办法：请参考2-f.

c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。

解决办法： 请参考2-d.

注意事项：

A 仔细阅读说明书。

B 检查试剂盒标签上的有效期。如果超过有效期，请勿使用。

C 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）。

D 标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存。

E 准备好所有实验额外所需物品，（比如移液器，试管，清洗器，酶标仪）。

F 按说明书将所用试剂平衡至室温，根据检测标本数量确定所需试剂的量。

G 检查试剂盒内每种试剂的贮存条件，保证所有试剂均按照试剂盒内说明书推荐的条件存储。

H 检查不稳定或者变质的试剂溶液（比如沉淀或变色）。有些试剂，比如标准品稀释液或者检测稀释液，可能在设计时就含有沉淀物。所有试剂在滴入酶标板之前，必需充分混匀。而由于沉淀物的特性，在加入酶标板之前，必需不停搅拌。

I 保证充分的孵育时间和温度。

J 切勿使用不同生产批号的试剂取代现有试剂或混合现有试剂。

K 在混合或溶解蛋白溶液时，避免泡沫产生。

L 在实验开始之前，安排好实验流程。

M 在实验开始之前，清洁工作台。

N 若有问题，应与我公司或代理商的技术支持联系

小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒结果判断:

1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

 特异性：

本试剂盒用于检测小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)，经检测与其它相似物质无明显交叉反应。

由于受到技术及样本来源的限制，不可能完成对所有相关或相似物质交叉反应检测，因此本试剂盒有可能与未经检测的其它物质有交叉反应。

回收率：

分别于定值血清及血浆样本中加入一定量的小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)（加标样品），重复测定并计算其均值，回收率为测定值与理论值的比率。

线性：

在定值血清及血浆样本内加入适量的小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)，并倍比稀释成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待测样本，线性范围即为稀释后样本中小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)含量的测定值与理论值的比率。

小鼠生长因子受体结合蛋白2(Grb2)酶联**吸附检测试剂盒精密度：
精密度用样品测定值的变异系数 CV 表示。CV(%) = SD/mean×100

批内差：取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测,每份样本连续测定 20 次，分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批间差：选取 3 个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定，每个样本使用同一试剂盒重复

测定 8 次，分别计算不同浓度样本的平均值及 SD 值。

批内差： CV<10%

批间差： CV<12%

稳定性：

经测定，试剂盒在有效期内按推荐温度保存，其活性降低率小于 5%。

为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。

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